[發明專利]一種表達巢蛋白的睪丸間質干細胞的分離、培養方法及其用途

在審

• 申請號: 201410469362.5
• 申請日: 2014-09-15
• 公開（公告）號: CN104212767A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 項鵬;姜美花;蔡炳;臧志軍;汪建成
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A61K35/48;A61P5/26
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司 44259
• 代理人: 姚迎新

技術領域

本發明涉及干細胞與組織工程技術領域，尤其涉及一種表達巢蛋白的睪丸間質干細胞的分離、培養方法及其用途。

背景技術

隨著社會老齡化問題的進程，中老年健康問題得到國際廣泛關注。遲發性性腺功能減退癥(Late-onset?hypogonadism.LOH)已經成為嚴重影響中老年男性健康和生活質量的重要疾病之一。LOH的核心機制是分泌睪酮的睪丸間質細胞隨著年齡的增長，數量減少和功能下降，導致體內的雄激素缺乏。睪酮不足最終可導致性欲、性功能的減退，還可造成疲勞、肌肉體積減少、脂肪體積增加、骨質疏松、貧血等癥狀，同時影響情緒與智力下降等嚴重影響活質量和引發多器官功能損害(Int?J?Androl,2009.32:1-10)。因此，睪酮水平的維持對男性意義重大。目前，睪酮替代治療是解決睪酮缺乏的主要手段，臨床上主要使用的是外源性睪酮制劑，按照給藥途徑可以分為口服睪酮制劑、肌注睪酮制劑、經皮膚黏膜吸收睪酮制劑以及睪酮埋置劑。許多研究表明睪酮替代治療已取得了良好的治療效果，例如：提高性欲、改善勃起功能、增加性滿意度。但隨后有報道顯示其治療效果會隨著時間的推移逐漸減弱；LOH患者的腰椎骨密度增加；效果難以持久。其原因在于給藥后血清睪酮濃度存在高峰和波谷，無法模擬機體睪酮的生理情況，也無法很好地預測個體的吸收模式。同時，外源性睪酮能夠通過抑制下丘腦-垂體-性腺軸，繼而導致睪丸局部睪酮濃度下降，最終引起精液質量下降，甚至導致男性不育。另外，體內雄激素水平升高可能會增加痤瘡、男性乳房發育、前列腺癌、脂質代謝紊亂、心血管事件等。因此，中老年男性性腺功能低下患者使用雄激素替代治療目前存在比較大的爭議。為此，研究人員一直在探索更為安全、有效、質優價廉的LOH治療方法。

葛仁山等人總結了成體睪丸間質細胞的發生過程，包括了四個發生階段：睪丸間質干細胞(stem?Leydig?cell，SLC)、睪丸間質祖細胞(Progenitor?Leydig?cell)、不成熟睪丸間質細胞(immature?Leydig?cell)、成體睪丸間質細胞(Adult?Leydig?cell)。其中，睪丸間質干細胞可以在體外擴增并分化成為具有睪酮分泌能力的睪丸間質細胞。在大鼠出生后7天，梭形的睪丸間質干細胞主要分布在大鼠睪丸間質部分以及血管周圍。Davidoff等認為睪丸的血管即血管平滑肌細胞及周細胞是睪丸間質細胞的前體細胞，被認為最理想的種子細胞(Davidoff?MS,Middendorff?R,Enikolopov?G,Riethmacher?D,Holstein?AF,Muller?D.Progenitor?cells?of?the?testosterone-producing?Leydig?cells?revealed.The?Journal?of?cell?biology?2004；167:935-944)。這一研究成果提示可以利用少量儲存的干細胞治療LOH患者進行治療，提高其臨床應用前景。然而，目前對睪丸間質干細胞的研究甚少，大多數局限在對其細胞器，組織結構和細胞分布上。對睪丸間質干細胞的體外分離及培養的探討，僅有應用Percoll密度梯度離心法，結合PDGFR-α陽性且LHR陰性細胞的免疫選擇(Immunoselection)法，純化出大鼠睪丸中PDGFR-α陽性且LHR陰性的細胞，并對其假定的睪丸間質干細胞做了體外增殖培養、定向分化為睪酮分泌的睪丸間質細胞。葛仁山等人將分離得到的睪丸間質干細胞移植入睪丸間質細胞損傷大鼠模型中，證明了睪丸間質干細胞可以在體內定植，并分化成有功能的睪丸間質細胞。這些研究，提示大鼠中的睪丸間質干細胞可以在體外進行培養和擴增，但是現行方法存在獲得細胞量少，細胞種類不明確，缺乏細胞鑒定標準等眾多弊端，明顯制約了臨床應用，需要進一步的深入研究。