[發(fā)明專利]一種表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法及其用途

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410469362.5
• 申請(qǐng)日: 2014-09-15
• 公開（公告）號(hào): CN104212767A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 項(xiàng)鵬;姜美花;蔡炳;臧志軍;汪建成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;A61K35/48;A61P5/26
• 代理公司: 廣州凱東知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44259
• 代理人: 姚迎新

1.一種表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，其特征在于：以C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型；

飼養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因小鼠模型的小鼠至1周齡，分離小鼠睪丸，用膠原酶IV消化，過濾消化后的細(xì)胞懸液，濾過篩網(wǎng)，獲得單個(gè)細(xì)胞，所述細(xì)胞產(chǎn)生受巢蛋白增強(qiáng)子控制的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白；

將上述單個(gè)細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，用C57B/6小鼠細(xì)胞做陰性對(duì)照細(xì)胞，收集表達(dá)綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度是陰性對(duì)照細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的10倍或以上的細(xì)胞，從而分離出所述表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞。

2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，其特征在于：所述巢蛋白-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型包含以巢蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的質(zhì)粒，其中，包括上游翻譯位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)域長2.5kb，包含第二個(gè)外顯子3’到第三個(gè)內(nèi)含子5’的增強(qiáng)子區(qū)域長1.8kb，多聚腺苷化位點(diǎn)與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白cDNA連接。

3.如權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，其特征在于：所述的分離方法的具體步驟如下：

利用C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型；利用出生后7天Nestin-GFP的雄性小鼠及7天的正常C57BL/6雄性小鼠，采用頸椎脫臼法處死，在無菌條件下打開陰囊部，取出雙側(cè)睪丸并在解剖顯微鏡下去除被膜和血管，暴露生精小管，用含1％雙抗的1×PBS反復(fù)沖洗，隨后用吸管及槍頭輕輕吹打，盡量使間質(zhì)組織與曲精細(xì)管分散開，并用小剪刀剪碎組織部分，隨后放入1mg/ml的IV型膠原酶溶液，于37℃、5％CO₂條件下孵育15min，加入大量含0.5％BSA的1×PBS終止膠原酶的消化，1500rmp離心5min；棄去上清液，用孔徑為40μm的尼龍網(wǎng)過濾懸液，去除曲細(xì)精管，收集的濾液以1500rmp離心5min后，將Nestin-GFP的陽性細(xì)胞懸液樣本和正常C57BL/6的陰性對(duì)照細(xì)胞樣本，經(jīng)流式分選收集表達(dá)綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度是陰性對(duì)照細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的10倍或以上的細(xì)胞，從而分離出所述表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞。

4.一種培養(yǎng)如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法得到的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于：將分離得到的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生自我更新和增殖的細(xì)胞，所述的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，其成分包括：DMEM-F12培養(yǎng)基中加入1nM地塞米松、1ng/ml?LIF,5mg/liter?insulin,5mg/litertransferrin,5ug/liter?sodium?selenite的ITS、5％雞胚提取物、0.1mMβ-巰基乙醇、1％非必需氨基酸、1％N2、2％B27(Gibco)、20ng/ml?bFGF、20ng/ml?EGF、20ng/ml?PDGFBB、20ng/ml?OSM。

5.一種如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法得到的表達(dá)巢蛋白的睪丸間質(zhì)干細(xì)胞用于制備治療睪酮水平低下導(dǎo)致相關(guān)疾病的藥物的用途。