[發明專利]一種表達巢蛋白的睪丸間質干細胞的分離、培養方法及其用途

在審

• 申請號: 201410469362.5
• 申請日: 2014-09-15
• 公開（公告）號: CN104212767A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 項鵬;姜美花;蔡炳;臧志軍;汪建成
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A61K35/48;A61P5/26
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司 44259
• 代理人: 姚迎新

1.一種表達巢蛋白的睪丸間質干細胞的分離方法，其特征在于：以C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色熒光蛋白轉基因小鼠模型；

飼養所述轉基因小鼠模型的小鼠至1周齡，分離小鼠睪丸，用膠原酶IV消化，過濾消化后的細胞懸液，濾過篩網，獲得單個細胞，所述細胞產生受巢蛋白增強子控制的增強型綠色熒光蛋白；

將上述單個細胞通過流式細胞儀進行分選，用C57B/6小鼠細胞做陰性對照細胞，收集表達綠色熒光蛋白的熒光強度是陰性對照細胞的熒光強度的10倍或以上的細胞，從而分離出所述表達巢蛋白的睪丸間質干細胞。

2.如權利要求1所述的表達巢蛋白的睪丸間質干細胞的分離方法，其特征在于：所述巢蛋白-綠色熒光蛋白轉基因小鼠模型包含以巢蛋白啟動子驅動表達增強型綠色熒光蛋白的質粒，其中，包括上游翻譯位點的啟動子區域長2.5kb，包含第二個外顯子3’到第三個內含子5’的增強子區域長1.8kb，多聚腺苷化位點與增強型綠色熒光蛋白cDNA連接。

3.如權利要求1或2所述的表達巢蛋白的睪丸間質干細胞的分離方法，其特征在于：所述的分離方法的具體步驟如下：

利用C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色熒光蛋白轉基因小鼠模型；利用出生后7天Nestin-GFP的雄性小鼠及7天的正常C57BL/6雄性小鼠，采用頸椎脫臼法處死，在無菌條件下打開陰囊部，取出雙側睪丸并在解剖顯微鏡下去除被膜和血管，暴露生精小管，用含1％雙抗的1×PBS反復沖洗，隨后用吸管及槍頭輕輕吹打，盡量使間質組織與曲精細管分散開，并用小剪刀剪碎組織部分，隨后放入1mg/ml的IV型膠原酶溶液，于37℃、5％CO₂條件下孵育15min，加入大量含0.5％BSA的1×PBS終止膠原酶的消化，1500rmp離心5min；棄去上清液，用孔徑為40μm的尼龍網過濾懸液，去除曲細精管，收集的濾液以1500rmp離心5min后，將Nestin-GFP的陽性細胞懸液樣本和正常C57BL/6的陰性對照細胞樣本，經流式分選收集表達綠色熒光蛋白的熒光強度是陰性對照細胞的熒光強度的10倍或以上的細胞，從而分離出所述表達巢蛋白的睪丸間質干細胞。

4.一種培養如權利要求1-3任一項所述的方法得到的表達巢蛋白的睪丸間質干細胞的方法，其特征在于：將分離得到的表達巢蛋白的睪丸間質干細胞在培養基中進行培養，產生自我更新和增殖的細胞，所述的培養基為無血清培養基，其成分包括：DMEM-F12培養基中加入1nM地塞米松、1ng/ml?LIF,5mg/liter?insulin,5mg/litertransferrin,5ug/liter?sodium?selenite的ITS、5％雞胚提取物、0.1mMβ-巰基乙醇、1％非必需氨基酸、1％N2、2％B27(Gibco)、20ng/ml?bFGF、20ng/ml?EGF、20ng/ml?PDGFBB、20ng/ml?OSM。

5.一種如權利要求1-4任一項所述的方法得到的表達巢蛋白的睪丸間質干細胞用于制備治療睪酮水平低下導致相關疾病的藥物的用途。