[發(fā)明專利]柑桔黃脈病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410467902.6
• 申請(qǐng)日: 2014-09-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104232795A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳洪明;周彥;王雪峰;李中安;唐科志;周常勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所 31219
• 代理人: 郭婧婧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)柑桔黃脈病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)用引物、試劑盒及檢測(cè)方法。?

背景技術(shù)

柑桔黃脈病(Citrus?yellow?vein?clearing?disease,CYVCD)，也稱檸檬黃脈病(Yellow?vein?clearing?of?Lemon)，是由柑桔黃脈病毒(Citrus?yellow?vein?clearing?virus,CYVCV)引起的。該病是Bové(1989)在巴基斯坦調(diào)查發(fā)現(xiàn)后命名的，Loconsole等(2012)通過(guò)深度測(cè)序技術(shù)，獲得了柑桔黃脈病毒的全基因組，該病毒由7529個(gè)(GenBank?Accession?No.JX040635)核苷酸的正義RNA鏈組成，它是威脅檸檬生產(chǎn)的重要病害之一。主要癥狀表現(xiàn)為葉片側(cè)脈及側(cè)脈附近脈明、黃化，對(duì)光看更為明顯，葉背可見(jiàn)側(cè)脈處水浸狀，部分葉片皺縮、反卷或船形葉，嫩葉癥狀表現(xiàn)明顯，到老葉癥狀也不消失。主要導(dǎo)致光合作用降低、樹(shù)勢(shì)減弱、減產(chǎn)20％左右。檸檬黃脈病目前主要發(fā)生在印度、巴基斯坦、土耳其等國(guó)家。?

到目前為止，世界上對(duì)該病害的研究較少，大都停留在生物學(xué)特性研究方面，近年在我國(guó)云南瑞麗、重慶、江西、四川安岳等地檸檬上也發(fā)生類似癥狀，是我國(guó)柑桔上的新發(fā)病害。本人近幾年研究結(jié)果表明該病害具有嫁接傳染性，對(duì)所有檸檬、酸橙品種都具有嫁接傳染性并具典型癥狀，對(duì)甜橙、寬皮柑桔也具有侵染性，但癥狀不明顯；能侵染辣椒和豇豆；柑桔黃脈病最適宜發(fā)病溫度為18～24℃，柑桔黃脈病病毒微粒為13～15×400～1000nm聯(lián)合絲狀，通過(guò)熱處理結(jié)合莖尖嫁接脫毒方法能有效脫除該病毒。這些研究結(jié)果與國(guó)外研究報(bào)道的相關(guān)結(jié)果相同。?

柑桔黃脈病毒對(duì)我國(guó)柑桔，尤其是檸檬的生產(chǎn)造成了極其嚴(yán)重的損失。目前還缺乏對(duì)該病有效的防治方法，使用無(wú)病毒苗木是防治柑桔黃脈病唯一有效的方法。為保證種苗安全，必須對(duì)采穗母樹(shù)和砧木進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)，并及時(shí)清除田間病樹(shù)，因此要求具備快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)體系。?

當(dāng)前在檢測(cè)CYVCV時(shí)主要采用指示植物鑒定的方法，該方法的檢測(cè)周期較長(zhǎng)，無(wú)法?滿足生長(zhǎng)上大量、快速檢測(cè)的需要。近年來(lái)，發(fā)明人創(chuàng)建的RT-PCR檢測(cè)體系雖可對(duì)CYVCV進(jìn)行快速檢測(cè)，但無(wú)法對(duì)植株中CYVCV的含量進(jìn)行定量分析，并且在植株發(fā)病早期，當(dāng)病毒含量較低時(shí)可能無(wú)法對(duì)該病進(jìn)行有效檢測(cè)。為此，需要建立更為靈敏的實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)體系。目前還沒(méi)有運(yùn)用實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)CYVCV的報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法對(duì)柑桔黃脈病毒(CYVCV)進(jìn)行檢測(cè)的引物、試劑盒及檢測(cè)方法等，可用于柑桔黃脈病毒(CYVCV)的田間早期快速診斷及定量檢測(cè)。?

本發(fā)明首先公開(kāi)了一種針對(duì)柑桔黃脈病毒(CYVCV)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)用引物，所述引物組成如下：?

上述針對(duì)柑桔黃脈病毒(CYVCV)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)用引物具體包括CYVCV上下游引物，用于擴(kuò)增柑桔黃脈病毒(CYVCV)。?

本發(fā)明第二方面公開(kāi)了一種柑桔黃脈病毒(CYVCV)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒的基本原理是利用一對(duì)靶多核苷酸的特異性引物，在本試劑盒PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中，通過(guò)熒光定量PCR擴(kuò)增儀實(shí)現(xiàn)靶核苷酸的循環(huán)擴(kuò)增，從而達(dá)到快速、定量檢測(cè)多核苷酸的目的。?

進(jìn)一步的，所述試劑盒包括柑桔黃脈病毒PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中含有前述的引物，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液能和該對(duì)引物的靶序列結(jié)合，產(chǎn)生高度靈敏、特異性高的檢測(cè)信號(hào)。?

較優(yōu)的，所述柑桔黃脈病毒PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中還含有GoTaq?qPCR?Master?Mix和H₂O。?

所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中，引物、GoTaq?qPCR?Master?Mix及H₂O均為常見(jiàn)組分，其含量亦為常規(guī)。?

較優(yōu)的，所述柑桔黃脈病毒PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的組成中，CYVCV上游引物(YSS-F)、CYVCV下游引物(YSS-R)的終濃度分別為50～500nM/L和50～500nM/L。?

更優(yōu)的，所述柑桔黃脈病毒PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的組成中，CYVCV上游引物(YSS-F)、CYVCV下游引物(YSS-R)的終濃度分別為200nM/L和200nM/L。?

較優(yōu)的，所述柑桔黃脈病毒PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括：?

柑桔黃脈病毒上游引物：10uM、0.5μL；?