[發明專利]柑桔黃脈病毒的實時熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201410467902.6
• 申請日: 2014-09-15
• 公開（公告）號: CN104232795A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 陳洪明;周彥;王雪峰;李中安;唐科志;周常勇
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院柑桔研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 郭婧婧

1.一種針對柑桔黃脈病毒的實時熒光定量RT-PCR法檢測用引物，其特征在于，所述引物的組成為：

柑桔黃脈病毒上游引物的基因序列如SEQ?ID?NO：1所示；

柑桔黃脈病毒下游引物的基因序列如SEQ?ID?NO：2所示。

2.一種柑桔黃脈病毒實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包括柑桔黃脈病毒PCR擴增反應液，所述柑桔黃脈病毒PCR擴增反應液中含有權利要求1所述的引物。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述柑桔黃脈病毒PCR擴增反應液中，柑桔黃脈病毒上游引物和下游引物的終濃度分別為50～500nM/L和50～500nM/L。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述柑桔黃脈病毒PCR擴增反應液中還含有GoTaq?qPCR?Master?Mix和H₂O。

5.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述柑桔黃脈病毒PCR擴增反應液包括：

柑桔黃脈病毒上游引物：10mM、0.5μL；

柑桔黃脈病毒下游引物：10mM、0.4μL；

GoTaq?qPCR?Master?Mix：10ug/ul、12.5μl；

CXR?Refernce?Dye：30uM、0.25μL；

ddH₂O：6.25μL。

6.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括反轉錄體系，所述反轉錄體系中包括柑桔黃脈病毒下游引物。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述反轉錄體系中，柑桔黃脈病毒下游引物的終濃度為50～500nM/L。

8.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述反轉錄體系包括：

9.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括陰性對照品及陽性對照品中的至少一種。

10.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照品包括含有SEQ?ID?NO：3所示目的擴增序列的柑桔黃脈病毒質粒；所述陰性對照為DEPC-H₂O。

11.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒所采用的PCR檢測體系如下：

柑桔黃脈病毒PCR擴增反應液?????20μL

待測品????????????????????????5μL

反應總體系為??????????????????25μL。

12.根據權利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述待測品為樣本核酸提取液反轉錄產物、陽性對照品或陰性對照品。

13.一種使用如權利要求1所述的引物或權利要求2-9任一權利要求所述試劑盒對柑桔黃脈病毒進行實時熒光定量RT-PCR檢測的方法，步驟如下：

1)制備植物樣本核酸提取液；

2)制備植物樣本核酸提取液反轉錄產物；

3)加樣：將柑桔黃脈病毒PCR擴增反應液置于PCR管中，將植物樣本核酸提取液反轉錄產物、陽性對照品或陰性對照品分別加入裝有檢測液的不同PCR管，獲得對應的樣本反應管、陽性反應管和陰性對照反應管；

4)PCR擴增：反應管置于定量熒光PCR儀上，設置循環參數，進行PCR擴增；

5)PCR反應結束后，檢測PCR反應體系的熒光信號值，閾值設定原則以閾值線剛好超過DEPC-H₂O的最高點。

14.根據權利要求1所述的引物或權利要求2-9任一權利要求所述試劑盒在制備柑桔黃脈病毒檢測試劑或診斷試劑中的應用。