[發明專利]一種提高淀粉酶熱穩定性的方法

在審

• 申請號: 201410465826.5
• 申請日: 2014-09-12
• 公開（公告）號: CN104212788A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 顧正彪;李才明;李兆豐;班宵逢;程力;洪雁
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N9/44;C12N9/26;C12N9/34;C12N9/24
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種提高淀粉酶熱穩定性的方法，屬于酶工程技術領域。

背景技術

在酶法合成過程中，酶的熱穩定性是很關鍵的一個因素。酶的熱穩定性高不僅可以延長酶的儲存時間、減少酶在運輸過程中酶活的損失，而且可以使酶在較高反應溫度下延長酶的反應時間，提高生產效率，進而有效的降低生產成本。

淀粉酶指作用于淀粉或其衍生物的一類酶，可催化水解或轉苷反應。淀粉酶在食品、醫藥、紡織等工業中具有十分廣泛的應用，提高淀粉酶的熱穩定性對于其工業化應用具有重要意義。

發明內容

本發明提供了一種提高酶熱穩定性的酶液，由酶和穩定劑組成，所述穩定劑活性成分為甘油和鉀離子。

所述酶液中甘油含量為5％-20％(w/v)，鉀離子濃度為0.1mM-1mM。

所述甘油含量為5％-20％(w/v)，是指每100mL酶液中含有甘油5g至20g。

所述酶液中酶的終濃度為5-20μM。

所述酶液，在本發明的一種實施方式中以水為溶劑。

所述鉀離子是除KOH外的能形成鉀離子的化合物，如KCl、KNO₃、K₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₃PO₄等。

所述酶液中的酶為淀粉酶

所述淀粉酶是淀粉分支酶、中溫α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、麥芽四糖生成酶或麥芽六糖生成酶中的任一一種。

所述淀粉酶優選淀粉分支酶。

本發明還提供一種提高酶的熱穩定性的方法，是將甘油和鉀離子用于提高酶的熱穩定性。

所述提高酶的熱穩定性的方法，是在酶液中加入以甘油和鉀離子為活性成分的穩定劑，混合后的酶液中甘油終濃度為5％-20％(w/v)，鉀離子終濃度為0.1mM-1mM。

所述提高酶的熱穩定性的方法，混合后的酶液中酶終濃度為5-20μM。

所述提高酶的熱穩定性的方法，是將淀粉酶加入以甘油和鉀離子為活性成分的體系中，混合后的酶液中甘油含量與酶液的質量體積比為5％-20％，鉀離子濃度為0.1mM-1mM。

經試驗確定，本發明對淀粉分支酶、中溫α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、麥芽四糖生成酶、麥芽六糖生成酶等均有一定效果。

本發明方案能夠提高淀粉酶熱穩定性的原因可能是甘油的添加能夠排斥酶分子周圍的滲透質，使酶優先水化，提高其構象的穩定性；鉀離子的添加能夠增強這種水化作用，同時有些酶上可能存在鉀離子結合位點，能夠進一步增強酶構象的穩定。本發明通過甘油與鉀離子的協同添加顯著提高淀粉酶的熱穩定性，大大提高了酶的工業化應用價值，同時該發明操作簡單、成本低廉，具有較好的推廣潛力。

附圖說明

圖1不同濃度甘油對淀粉分支酶熱穩定性的影響，其中，■：未添加甘油；★：20％甘油；◇：10％甘油；△：7.5％甘油；○：5％甘油

圖2不同濃度鉀離子對淀粉分支酶熱穩定性的影響，其中，■：未添加鉀離子；○：0.1mM鉀離子；△：0.5mM鉀離子；◇：1mM鉀離子

圖3甘油和鉀離子對淀粉分支酶熱穩定的影響，其中，■：未添加助劑；○：10％甘油；△：10％甘油和0.5mM鉀離子

具體實施方式

實施例1

淀粉分支酶的熱穩定性分析方法：淀粉分支酶在一定溫度下保溫，不同時間點取樣，迅速冷卻至0℃，測定酶的殘余活力，以未保溫酶液的活力為100％。繪制相對酶活與時間的曲線。

淀粉分支酶活力的測定方法：取適當稀釋的酶液300μL，加入裝有預先用50mM的MOPS緩沖液(pH7.0)配制的100mg/mL直鏈淀粉溶液中，在50℃下反應120min。反應結束后沸水浴中滅酶15min。將反應液在室溫下保溫20min后，離心取上清液1mL，加入1mL醋酸鈉緩沖液(pH3.5)和100μL異淀粉酶(1000U，Sigma，I5284)，在37℃下200r/min的搖床中反應20h。反應結束后在沸水浴中滅酶15min，利用二硝基水楊酸法測定體系中還原糖量。一個酶活單位定義為單位時間內產生1mmol的α-1,6糖苷鍵所需要加入淀粉分支酶的量。

實施例2