[發明專利]基于外切葡聚糖酶的工程菌及其實現方法

在審

• 申請號: 201410462541.6
• 申請日: 2014-09-12
• 公開（公告）號: CN104232558A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 周培;馮海瑋;支月娥;孫玉靜;羅艷青
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/42;C12R1/19
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

1.一種外切葡聚糖酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達外切葡聚糖酶的大腸桿菌；?

所述的胞內外切葡聚糖酶具體為灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)JSD‐1外切葡聚糖酶基因SG‐CX，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，編碼該外切葡聚糖酶核苷酸序列為1737bp，共編碼578個氨基酸，其中信號肽切割位于N端第32個氨基酸與第33個氨基酸之間。?

2.根據權利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)JSD‐1，現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC?No.5706，保藏日期為2012年1月9日。?

3.一種根據權利要求1或2中所述的工程菌的實現方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點和谷胱甘肽標簽的引物進行PCR擴增得到編碼外切葡聚糖酶的核苷酸序列；然后將擴增得到的基因序列連接到表達載體pET‐41a(+)，再將獲得的連接產物轉入大腸桿菌表達菌株內，獲得外切葡聚糖酶過表達重組菌株。?

4.根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點和谷胱甘肽標簽的引物，即含有Spe?I和EcoR?I酶切位點引物，具體包括：?

CX‐Spe?I‐F:GACTAGTGCCGCCGTCCCCTGCACCGTGGA?

CX‐EcoR?I‐R:GGAATTCTCACGACACCGGCGGGTAGGCGT。?

5.根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR擴增的條件為：98℃預變性3min；98℃變性10s，68℃延伸45s；30個循環后68℃終延伸3min。?

6.根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。?

7.一種根據上述任一權利要求所述的外切葡聚糖酶的工程菌的應用，其特征在于，將其用于外切葡聚糖酶的體外高效表達，并用于外切葡聚糖酶的規模化發酵生產。?