[發明專利]基于外切葡聚糖酶的工程菌及其實現方法

在審

• 申請號: 201410462541.6
• 申請日: 2014-09-12
• 公開（公告）號: CN104232558A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 周培;馮海瑋;支月娥;孫玉靜;羅艷青
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/42;C12R1/19
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

技術領域

本發明涉及的是一種生物基因工程技術領域的基因及其工程菌株，具體是一種灰略紅鏈霉菌的基于胞外外切葡聚糖酶的工程菌及其實現方法。?

背景技術

木質纖維素是植物界中最為豐富的天然高分子化合物，是植物通過光合作用產生的主要干物質，主要包括纖維素、半纖維素和木質素。據估計，每年全世界綠色植物光合作用產生的木質纖維素總干重為1730億t，所含總能量可達2×10¹⁸kJ，相當于每年全世界消耗能量的10倍。木質纖維素的生物降解和解聚作用是一個高度復雜的過程，它涉及眾多酶系的參與。?

木質纖維素中的纖維素組分是由葡萄糖組成的大分子多糖，不溶于水及一般有機溶劑，性質穩定；纖維素降解需要纖維素酶的參與，纖維素酶并不是一種簡單的酶，而是由若干種相互關聯的酶組成的一個復雜的酶系統，主要由3類組成：內切‐β‐1,4‐葡聚糖酶(Endo‐β‐1,4‐glucanase)，又被稱為Cen酶；外切葡聚糖酶(Exoglucanses)，又被稱為Cex酶；β‐葡萄糖苷酶(β‐glucosidase)，又被稱為BG酶。目前普遍接受的觀點是3種酶協同作用于纖維素的降解過程，即首先由Cen酶在纖維素聚合物的內部起作用，在纖維素的非結晶部位進行切割，產生新的末端，然后再由外切葡聚糖酶以纖維二糖為單位，從末端進行水解，最后由CB酶將纖維二糖徹底水解為葡萄糖。因此，外切葡聚糖酶(Cex)在纖維素徹底水解過程中起十分關鍵的作用。?

目前，各種纖維素酶基因均已在細菌中發現并被克隆。與真核生物纖維素酶基因相比，細菌纖維素酶基因具有不含內含子、易克隆、易表達及種類多等優勢。其中灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)是一種常見的土壤細菌(或放線菌)。之前，鏈霉菌研究重點為如何改造其代謝途徑以提高抗生素尤其是鏈霉素的發酵產量，對其基因組內其他功能基因的開發和利用還相對不足。?

與大多數細菌相比，鏈霉菌具有較為復雜的生長分化機制，對大分子多糖物質如纖維素有很強的分解利用能力。因此，研究鏈霉菌對大分子多糖物質的分解利用機制，發現全新的纖維素酶基因序列并對目的基因進行外源表達，對新型纖維素酶制劑的開發及生產具有重大意義。?

經過對現有技術的檢索發現：中國專利文獻號CN101307295公開(公告)日2008.11.19，公開了一種表達嗜熱毛殼菌(Chaetomium?thermophilum)熱穩定外切－β－1，4－葡聚糖酶基因cbh3的畢赤酵母工程菌Pichia?pastoris?GS－CBH3－27。通過RT－PCR及RACE方法從嗜熱毛?殼菌獲得外切－β－1，4－葡聚糖酶基因cbh3，然后將得到的外切－β－1，4－葡聚糖酶基因cbh3表達載體pPIC9K/cbh3導入到畢赤酵母GS115中，從中篩選出了表達外切－β－1，4－葡聚糖酶的酵母工程菌GS－CBH3－27。該工程菌外切－β－1，4－葡聚糖酶表達量高達1.7mg/mL，酶在60℃是穩定的，在70℃保溫60min，仍有60％的活性，80℃的半衰期為10min，具熱穩定性，用于轉化植物纖維素的生物降解，具有較高經濟價值和社會價值。但該工程菌在堿性條件下的酶學性質難以滿足現有工業需要。?

發明內容

本發明針對現有技術存在的由于外切葡聚糖酶在生物體內多為胞內酶且表達量較低導致的應用范圍和效果嚴重受限等不足，提出一種基于外切葡聚糖酶的工程菌及其實現方法，通過構建外源表達載體，優化蛋白誘導表達的條件和融合標簽等方法，實現了外切葡聚糖酶的胞外過表達，本發明不僅在高溫條件下具有較高的生物學活性，此外在堿性條件下也可以維持穩定的酶學性質。?

本發明是通過以下技術方案實現的：?

本發明涉及一種外切葡聚糖酶的工程菌，該工程菌為外源表達外切葡聚糖酶的大腸桿菌。?

所述的胞內外切葡聚糖酶具體為灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)JSD‐1胞外外切葡聚糖酶基因SG‐CX，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，編碼該外切葡聚糖酶核苷酸序列為1737bp，共編碼578個氨基酸，其中信號肽切割位于N端第32個氨基酸與第33個氨基酸之間。?