[發(fā)明專利]基于金黃色葡萄球菌的生物探針、制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410462482.2
• 申請(qǐng)日: 2014-09-11
• 公開（公告）號(hào): CN104198737A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 危宏平;胡偉;楊航;余軍平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院武漢病毒研究所
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 北京超凡志成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳開磊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物病原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種基于金黃色葡萄球菌的生物探針、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

典型的金葡菌(金黃色葡萄球菌)為球型，直徑0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金葡菌無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜，革蘭氏染色陽性。金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococal?Protein?A，SPA)，或簡稱表面A蛋白,占整個(gè)細(xì)胞壁蛋白成分的6.7％，通過胞壁肽聚糖以共價(jià)鍵與之結(jié)合。

多數(shù)表面A蛋白呈一側(cè)面稍凹的橢球形結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、均一，長約為40.88±1.58nm，寬約為20.82±0.68nm，高約為10.51±0.28nm。

表面A蛋白由亮、纈、脯、丙、蘇、甘、絲、谷丙、天門冬及賴氨酸等十種氨基酸組成。由于其不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以無二硫鍵。紫外光譜和吸收系數(shù)為A275nm％＝1.65，等電點(diǎn)為pH5.1。表面A蛋白十分穩(wěn)定，用4mol/L尿素、硫氰鹽酸、6mol/L的鹽酸胍和pH2.5的酸性條件，以及加熱煮沸均不影響其活性。

表面A蛋白能與人及多種哺乳動(dòng)物血清IgG分子中的Fc片段結(jié)合，結(jié)合的親和性次序依次是豬、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛；對(duì)大白鼠、綿羊的親和力差；對(duì)馬、犢牛、山羊等無親和力；對(duì)所有的魚類、兩棲類、爬行類、鳥類(除少數(shù)例外)均不能與之結(jié)合。基于金黃色葡萄球菌A蛋白的免疫學(xué)性質(zhì)，預(yù)示著其可以作為載體并與已知的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行修飾吸附，進(jìn)而獲得吸附有抗體的載體，通過進(jìn)行協(xié)同凝集反應(yīng)并應(yīng)用到檢測(cè)相應(yīng)的未知抗原中。雖然，上述的方式其檢測(cè)未知抗原的特異性和敏感性均較好，但是，相關(guān)技術(shù)中，由于對(duì)金黃色葡萄球菌沒有進(jìn)行特定的處理，因此，在鑒定其協(xié)同凝集后的凝集產(chǎn)物時(shí)，其分辨率差(常需要借助大型的儀器進(jìn)行分析辨別)，因此，不易判定其凝集結(jié)果，進(jìn)而嚴(yán)重影響了其在免疫學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用。

綜上，提供一種便于觀測(cè)凝集結(jié)果的金黃色葡萄球菌的生物探針并應(yīng)用到抗原檢測(cè)中是本領(lǐng)域亟待解決的一個(gè)技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于金黃色葡萄球菌的生物探針；以解決上述的問題。本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供一種上述生物探針的制備方法，并實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用。

在本發(fā)明的實(shí)施例中提供了一種基于金黃色葡萄球菌的生物探針，包括：金葡菌載體以及標(biāo)記在所述金葡菌載體的表面A蛋白上，且能夠與被檢測(cè)抗原特異性結(jié)合的抗體；其中，所述金葡菌載體被四唑氯化物染料染至紅色。

本發(fā)明提供的這種基于金黃色葡萄球菌的生物探針，金黃色葡萄球菌作為基本的結(jié)構(gòu)組成，由于其細(xì)胞壁上含有一定量結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的表面A蛋白，而該表面A蛋白則可以和多種動(dòng)物血清中的IgG分子中的Fc片段結(jié)合，即其表面A蛋白可以和標(biāo)記有被檢測(cè)抗原特異性結(jié)合的抗體，通過抗體與未知抗原的特異性結(jié)合以及發(fā)生的協(xié)同凝集反應(yīng)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗原的檢測(cè)。更為重要的，由于金葡菌載體是被四唑氯化物染料染至紅色的，具體的，四唑氯化物染料可被金葡菌內(nèi)部所含的各類氧化還原酶作用，生成紅色的不溶物(在細(xì)菌內(nèi)部發(fā)生)，進(jìn)而使得整個(gè)金葡菌顯現(xiàn)出紅色，即得到紅色的金葡菌載體。因此，該紅色的載體與相應(yīng)的抗體標(biāo)記之后(生物探針)，其與特定的抗原發(fā)生協(xié)同凝集反應(yīng)時(shí)，生物探針兼具乳膠微球和紅細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)，顆粒均一、穩(wěn)定，與抗原結(jié)合能力以及凝集性能強(qiáng)，顏色鮮明，使得凝集結(jié)果非常易于判定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該體系的凝集反應(yīng)的分辨率、靈敏度和特異性都得到了很大的提高，因此，可有效地應(yīng)用到免疫學(xué)檢測(cè)中。

可選的，四唑氯化物染料具體為5-氰基-2，3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物。

一種上述的生物探針的制備方法，包括以下步驟：

1)、利用LB平板劃線分離出金葡菌，再利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到OD600為0.5-1.5的金葡菌懸液；

2)、在所述金葡菌懸液中加入四唑氯化物染料，并使得所述四唑氯化物染料的終濃度達(dá)到1-10mM，染色10-30min，得到紅色菌懸液；

3)、將所述紅色菌懸液依次進(jìn)行離心收集菌體、緩沖液清洗、重懸以及滅活，得到紅色的金葡菌載體懸液；

4)、將紅色的所述金葡菌載體懸液與能夠和被檢測(cè)的抗原特異性結(jié)合的抗體混合后依次進(jìn)行孵育、離心收集沉淀、緩沖液清洗以及重懸，得到標(biāo)記有抗體的菌懸液；

5)、將所述標(biāo)記有抗體的菌懸液中加入封閉劑后顛倒混勻，進(jìn)行封閉處理，得到紅色的生物探針。

可選的，在步驟4)中，所述抗體包括單克隆抗體或多克隆抗體；在步驟5)中，所述封閉劑包括脫脂奶粉或牛血清蛋白。