[發明專利]基于胞外漆酶的工程菌及其實現方法

在審

• 申請號: 201410462414.6
• 申請日: 2014-09-12
• 公開（公告）號: CN104232557A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 周培;馮海瑋;孫玉靜;支月娥
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/02;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

技術領域

本發明涉及的是一種生物基因工程技術領域的基因及其工程菌株，具體是一種灰略紅鏈霉菌的基于胞外漆酶的工程菌及其實現方法。?

背景技術

木質纖維素是植物界中最為豐富的天然高分子化合物，是植物通過光合作用產生的主要干物質，主要包括纖維素、半纖維素和木質素。木質纖維素的生物降解和解聚作用是一個高度復雜的過程，它涉及眾多酶系的參與。木質纖維素中的木質素是由四種醇單體(對香豆醇、松柏醇、5‐羥基松柏醇、芥子醇)形成的一種復雜酚類聚合物。木質素是構成植物細胞壁的成分之一，具有聯結強化細胞的作用。此外，木質素也是一種含許多負電集團的多環高分子有機物，對土壤中的高價金屬離子有較強的親和力。?

根據單體的不同，可將木質素分為3種類型：由紫丁香基丙烷結構單體聚合而成的紫丁香基木質素(S‐木質素)，由愈創木基丙烷結構單體聚合而成的愈創木基木質素(G‐木質素)和由對‐羥基苯基丙烷結構單體聚合而成的對‐羥基苯基木質素(H‐木質素)。一般而言，木質素在裸子植物主要存在類型為愈創木基木質素(G)，雙子葉植物主要含愈創木基‐紫丁香基木質素(G‐S)，單子葉植物則為愈創木基‐紫丁香基‐對‐羥基苯基木質素(G‐S‐H)。從植物學觀點出發，木質素就是包圍于管胞、導管及木纖維等纖維束細胞及厚壁細胞外的物質；從化學觀點來看，木質素是由高度取代的苯基丙烷單元隨機聚合而成的高分子，它與纖維素、半纖維素一起，形成植物骨架的主要成分，在數量上僅次于纖維素。木質素填充于纖維素構架中增強植物體的機械強度，利于輸導組織的水分運輸和抵抗不良外界環境的侵襲。?

木質素單體同時含有多種活性官能團，如羥基、羰基、羧基、甲基及其它側鏈結構。其中羥基在木質素中存在較多，以醇羥基和酚羥基兩種形式存在，而酚羥基的多少又直接影響木質素的物理和化學結構，如能反映出木質素的醚化和縮合程度，同時也能衡量木質素的溶解性能和反應能力；在木質素的側鏈上，有對羥基安息香酸、香草酸、紫丁香酸、對羥基肉桂酸、阿魏酸等酯型結構存在，這些酯型結構存在于側鏈的α位或γ位。在側鏈α位除了酯型結構外，還有醚型連接或作為聯苯結構的碳‐碳聯結。同酚羥基一樣，木質素的側鏈結構也直接關系它的化學特性。?

由于木質素的復雜結構、高分子量及高度疏水性，與纖維素與半纖維素相比，木質素的降解相對緩慢。已發現木質素降解酶主要有3類：漆酶(laccase)、錳過氧化物酶(manganese??peroxidase)和木質素過氧化物酶(lignin?peroxidase)。漆酶作為一種多銅氧化酶(multiple?copper?oxidase)，在木質素的降解過程中起到了十分關鍵的作用。?

灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)是一種廣泛存在于土壤的細菌，具有很強的木質素降解能力并得到了研究者越來越多的關注。明確其降解木質素的分子機制，通過基因工程手段克隆并表達木質素降解關鍵酶，對于開發新型木質素降解酶制劑進而實現木質素乃至木質纖維素的快速降解具有重要意義。?

經過對現有技術的檢索發現：中國專利文獻號CN103305481A公開(公告)日2013.09.18，公開了一種發酵齒毛菌生產漆酶的方法。該方法包括在液體培養基中培養一色齒毛菌(Cerrena?unicolor)，收集發酵液或/和菌絲體的步驟，所述一色齒毛菌(Cerrena?unicolor)的菌株號為GSM‐01，其在保藏編號為CGMCC?No.7713。一色齒毛菌(Cerrena?unicolor)GSM‐01CGMCC?No.7713在1.0mmol/L?Cu²⁺培養基中在25℃發酵192小時的一色齒毛菌(Cerrena?unicolor)GSM‐01CGMCC?No.7713的胞外漆酶產量為2855.00±41.63U/mL發酵液。但該技術所產漆酶在高溫、高pH等環境下難維持較高的生物學穩定性及活性，因此應用范圍受限。?

中國專利ZL?201210144682.4，公告日2013.9.25，公開了一株秸稈降解放線菌及其應用。該技術的秸稈降解放線菌，屬于灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)，保藏編號為CGMCC?No.5706。但該技術產量較低，難以滿足生產需求。?

發明內容