[發(fā)明專利]基于胞外漆酶的工程菌及其實現(xiàn)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410462414.6
• 申請日: 2014-09-12
• 公開（公告）號: CN104232557A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發(fā)明（設計）人: 周培;馮海瑋;孫玉靜;支月娥
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/02;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

1.一種胞外漆酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達胞外漆酶的大腸桿菌；?

所述的胞內(nèi)胞外漆酶具體為灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)JSD-1胞外漆酶的人工合成基因，即SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列編碼，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示，編碼該漆酶核苷酸序列為990bp，共編碼329個氨基酸，其中信號肽切割位點位于N端第30與31個氨基酸之間。?

2.根據(jù)權利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的SEQ?ID?NO.2通過對灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)JSD‐1的漆酶基因進行密碼子優(yōu)化后得到的核苷酸序列，該灰略紅鏈霉菌(Streptomyces?griseorubens)JSD‐1，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC?No.5706，保藏日期為2012年1月9日，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所郵編100101，所述的漆酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

3.一種根據(jù)權利要求1或2中所述的工程菌的實現(xiàn)方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點和聚組氨酸標簽的引物進行PCR擴增得到編碼胞外漆酶的核苷酸序列；然后將擴增得到的基因序列連接到表達載體pET‐22b(+)，再將獲得的連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌表達菌株內(nèi)，獲得胞外漆酶過表達重組菌株。?

4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點和聚組氨酸標簽的引物即含有Msc?I和BamH?I酶切位點引物，包括：?

Lac‐Msc?I‐F：?

GATGGCCATGCATCATCATCATCATCATCATCATCATCATGCTACCGCTACCGCTCGTAC?

Lac‐BamH?I‐R：CGGGATCCTTAGTGAGCGTGACCCGGTTTTTC。?

5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR擴增的條件為：98℃預變性3min；98℃變性10s，68℃延伸45s；30個循環(huán)后68℃終延伸3min。?

6.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達菌株為TransB(DE3)大腸桿菌。?

7.一種根據(jù)上述任一權利要求所述的胞外漆酶的工程菌的應用，其特征在于，將其進行胞外漆酶的體外高效表達，并用于造紙及污水處理中的木質(zhì)纖維素降解過程中。?