[發(fā)明專利]銅綠假單胞菌突變株構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410458141.8
• 申請(qǐng)日: 2014-09-04
• 公開（公告）號(hào): CN105647841A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇靜;符軍;陳敏文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇靜
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C07K14/21;C12N15/74;A61K39/104;A61P31/04;A61P35/00;A61P37/02;C12R1/385
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技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及基因工程突變菌，特別是銅綠假單胞菌基因工程突變菌，尤其是銅綠假單胞菌外毒素A減毒株，還涉及其制備方法以及該突變菌或減毒株在制備疫苗或輔助治療藥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Pa)又稱綠膿桿菌，是一種需氧型的革蘭氏陰性菌，無芽胞，有數(shù)根菌毛和單一端生鞭毛，廣泛分布于土壤、水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道中。該菌是一種條件致病菌，只在某種特定條件下才能致病。由于機(jī)體抵抗力降低，被嚴(yán)重?zé)齻蚧即x性疾病、血液病、惡性腫瘤的患者，以及術(shù)后或某些治療后的患者比較容易感染該菌。

許多重癥病人因其免疫力低下經(jīng)常發(fā)生嚴(yán)重的綠膿桿菌感染并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)為肝、腎、肺細(xì)胞壞死、腎出血、脂肪性變、低血壓性休克等，其中以肝細(xì)胞壞死最為嚴(yán)重。1972年，P.V.Liu在臨床分離株的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致綠膿桿菌感染的毒性因子-外毒素A，并指出綠膿桿菌外毒素A(PEA)對(duì)皮膚粘膜有壞死作用，進(jìn)入血液中能誘發(fā)敗血癥。在臟器組織細(xì)胞中，綠膿桿菌外毒素A與白喉毒素類似，具有阻礙蛋白質(zhì)合成的作用；小鼠和大鼠對(duì)其敏感性高，具有致死作用；對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞有“細(xì)胞崩壞毒性”[YatesSP，MerrillAR.Elucidationofeukaryoticelongationfactor-2contactsiteswithinthecatalyticdomainofPseudomonaaeruginosaexotoxinA.TheBiochemicalJournal，2004，379：563～572.]。研究人員在之后更加深入的研究中發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌的多種菌體成分和產(chǎn)物(內(nèi)毒素、外膜蛋白、纖毛、堿性蛋白酶、細(xì)胞外酶S、磷脂酶C、彈性蛋白酶、外毒素A、殺白細(xì)胞素、溶血酶等)在其致病性中起著不同的作用。大多數(shù)革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素毒性較強(qiáng)，而綠膿桿菌恰恰相反，其外毒素A的毒性最強(qiáng)，是其分泌的一種毒力很強(qiáng)的致死性外毒素(HwangJ，1987)，已被國內(nèi)外學(xué)者證實(shí)它是引起感染的內(nèi)在機(jī)制，是最主要的致病因子之一。

傳統(tǒng)的細(xì)菌疫苗多注重在刺激宿主產(chǎn)生抗體，以對(duì)抗病原菌或加強(qiáng)巨噬細(xì)胞的噬菌能力，進(jìn)而阻止細(xì)菌在患者體內(nèi)繁衍。綠膿桿菌外毒素A是綠膿桿菌致病的最重要的內(nèi)在機(jī)制，嚴(yán)重感染綠膿桿菌但能夠存活下來的患者，其體內(nèi)的抗綠膿桿菌外毒素A抗體的濃度都很高；因感染而死亡的患者，其體內(nèi)卻含有較低濃度的抗綠膿桿菌外毒素A抗體。此外，免疫力低下的患者可以通過使用抗綠膿桿菌外毒素A抗體使自己免受綠膿桿菌感染的威脅。但是綠膿桿菌外毒素A的毒性很強(qiáng)，如何利用基因工程方法降低或消除PEA的毒性，發(fā)展更安全、有效的綠膿桿菌疫苗，是科學(xué)家的研究重點(diǎn)之一。

以往消除PEA毒性都是用福爾馬林處理，使其蛋白變性，制成沒有毒性的類毒素。再用類毒素免疫家兔，產(chǎn)生免疫應(yīng)答后取兔血，血清即為抗PEA抗體。這種減毒方法仍有可能產(chǎn)生有害的毒素。因此就有科學(xué)家利用基因工程的技術(shù)讓綠膿桿菌外毒素A的毒性消失，但仍然保留大部分抗原性，而成為無毒性的綠膿桿菌外毒素A類毒素。利用這種類毒素，可以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，中和綠膿桿菌外毒素A的毒害作用。這比先前用福爾馬林處理綠膿桿菌外毒素A制造類毒素疫苗的傳統(tǒng)方法更安全，而且抗原性也較強(qiáng)。

PEA蛋白既有B細(xì)胞表位，又有T細(xì)胞表位，能誘導(dǎo)良好的體液免疫和細(xì)胞免疫，是極有希望的疫苗候選分子。研究和開發(fā)Pa疫苗，對(duì)于預(yù)防和治療Pa感染具有十分重要的意義。它不僅可作為疫苗蛋白，也是一種重要的疫苗佐劑和疫苗載體。然而由于天然PEA的細(xì)胞毒性較強(qiáng)，不能直接作為疫苗佐劑和載體應(yīng)用于疫苗的生產(chǎn)，必須通過基因工程方法對(duì)其進(jìn)行基因改造使其毒性降低或完全脫毒才能應(yīng)用。