[發(fā)明專利]銅綠假單胞菌突變株構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410458141.8
• 申請日: 2014-09-04
• 公開（公告）號: CN105647841A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇靜;符軍;陳敏文
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇靜
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C07K14/21;C12N15/74;A61K39/104;A61P31/04;A61P35/00;A61P37/02;C12R1/385
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.銅綠假單胞菌，其中外毒素A蛋白已被減毒，優(yōu)選外毒素A 蛋白中選自以下位置的氨基酸突變或缺失：

對應(yīng)于SEQIDNO：1的Lys82、His271、Arg272、His274、 Arg304、Glu578。

2.權(quán)利要求1的銅綠假單胞菌，其中其外毒素A蛋白中對應(yīng)于 SEQIDNO：1的Glu578突變或缺失。

3.權(quán)利要求2的銅綠假單胞菌，其中其外毒素A蛋白中對應(yīng)于 SEQIDNO：1的Glu578突變?yōu)锳sp。

4.權(quán)利要求2的銅綠假單胞菌，其中其外毒素A蛋白中對應(yīng)于 SEQIDNO：1的Glu578缺失。

5.制備基因工程突變菌的方法，包括：

(1)從細(xì)菌基因組中的待突變基因擴(kuò)增第一片段和第二片段，所 述第一片段含有從該基因第一端至突變位點(diǎn)前的序列，而第二片段 含有該基因另一端編碼區(qū)之外的序列，例如第一片段為該基因中突 變位點(diǎn)前的上游序列，而第二片段為該基因編碼區(qū)之后的序列，或 者第一片段為該基因中突變位點(diǎn)之后的下游序列，而第二片段為該 基因編碼區(qū)之前的序列；

(2)將第一片段和第二片段插入轉(zhuǎn)移載體中，所述轉(zhuǎn)移載體優(yōu)選 能通過細(xì)菌間基因轉(zhuǎn)移、更優(yōu)選通過細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移而從供體菌轉(zhuǎn) 移到受體菌，所述轉(zhuǎn)移載體含有第一抗性基因和第二抗性基因，并 且第一抗性基因兩側(cè)帶有同源重組位點(diǎn)LoxP，第一片段和第二片段 插入到LoxP-第一抗性基因-LoxP兩側(cè)用作同源臂，構(gòu)建缺失載體， 所述載體例如為質(zhì)粒；

(3)通過設(shè)計(jì)在突變位點(diǎn)帶有突變的引物，經(jīng)由PCR擴(kuò)增引入所 述突變，將含有從基因第一端至突變位點(diǎn)前的(例如上游序列或下游 序列)、突變位點(diǎn)的所述突變以及突變位點(diǎn)后到基因另一端(例如終 止子)的序列(例如下游序列或上游序列)的序列，利用同源重組，將 其插入到所述轉(zhuǎn)移載體中，替換轉(zhuǎn)移載體中第一抗性基因和一個(gè) loxP位點(diǎn)，構(gòu)建突變載體；

(4)將能促進(jìn)細(xì)菌間基因轉(zhuǎn)移、優(yōu)選細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的輔助菌、 作為供體菌的含有缺失載體的細(xì)菌和作為受體菌的待突變細(xì)菌一起 培養(yǎng)，篩選通過同源重組而具有第一抗性但無第二抗性的第一重組 子，第一重組子在帶突變基因中自突變位點(diǎn)至終止子的序列被 LoxP-第一抗性基因-LoxP所取代，其中所述輔助菌優(yōu)選能促進(jìn)細(xì)菌 間接合轉(zhuǎn)移的細(xì)菌，更優(yōu)選含有質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌，如大腸 桿菌HB101；

(5)將能促進(jìn)細(xì)菌間基因轉(zhuǎn)移的輔助菌、作為供體菌的含有待轉(zhuǎn) 移的突變載體的細(xì)菌和作為受體菌的第一重組子一起培養(yǎng)，篩選以 突變位點(diǎn)前的上游序列作為同源臂、通過同源重組經(jīng)過單雜交而產(chǎn) 生的具有第二抗性而無第一抗性的第二重組子，第二重組子含有帶 有所述突變的完整的突變基因并且含有整個(gè)突變載體，其中所述輔 助菌優(yōu)選能促進(jìn)細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的細(xì)菌，更優(yōu)選大腸桿菌 HB101(pRK2013)；

(6)將帶有第三抗性基因的Cre表達(dá)載體引入第二重組子中，篩 選具有第三抗性而無第一抗性和第二抗性的第三重組子，在第三重 組子中慶大霉素抗性和四環(huán)素抗性這兩個(gè)抗性基因以及其他的載體 序列通過重組已被缺失；

(7)培養(yǎng)第三重組子，選擇丟失了Cre表達(dá)載體的第三抗性為陰 性的菌株，得到所述基因被突變的基因工程菌，

所述基因工程突變菌優(yōu)選為銅綠假單胞菌，更優(yōu)選為外毒素A 蛋白減毒菌。

6.權(quán)利要求5的方法，其中所述基因工程突變菌為銅綠假單胞 菌，其外毒素A蛋白已被減毒，優(yōu)選外毒素A蛋白中選自以下位置 的氨基酸突變或缺失：

對應(yīng)于SEQIDNO：1的Lys82、His271、Arg272、His274、 Arg304、Glu578。

7.用權(quán)利要求5或6的方法制備的銅綠假單胞菌基因工程減毒 菌，所述減毒菌優(yōu)選為外毒素A蛋白減毒菌。

8.銅綠假單胞菌外毒素A蛋白，所述蛋白是從權(quán)利要求1-4中 任一項(xiàng)的銅綠假單胞菌或權(quán)利要求7的銅綠假單胞菌基因工程減毒 菌中分離的。