[發明專利]一種基于酸中心復合物的免疫傳感器的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201410457671.0
• 申請日: 2014-09-09
• 公開（公告）號: CN104297478A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 任祥;杜斌;閆濤;魏琴;馬洪敏;吳丹
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/532;G01N27/26
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技術領域

本發明涉及一種酸中心復合物電化學免疫傳感器的制備方法及應用。具體是采用FA@PANI@CS-HCl制備一種檢測腫瘤標志物的電化學免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測技術領域。

背景技術

癌癥是一大類惡性腫瘤的統稱。腫瘤在發生發展過程中，腫瘤細胞異常表達或宿主細胞對腫瘤反應后產生的某些物質,如腫瘤特異性抗原、胚胎抗原、某些分化抗原、激素和同工酶等,可作為腫瘤標志物，用于臨床某些腫瘤的診斷和輔助診斷。因此，在臨床研究上，發展一種快速、簡便、靈敏的檢測腫瘤標志物方法是十分重要的。

電化學免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、結構簡單、操作簡便、易于小型化、可連續、快速自動化檢測分析等優點，因此本發明制備了一種合金負載分子篩電化學免疫傳感器，實現了對腫瘤標志物的檢測。

目前已有的腫瘤標志物的臨床檢測方法很多,如放射免疫分析、化學發光免疫分析、酶聯免疫分析等。免疫傳感器是將免疫學方法與分析化學方法相結合的一種生物傳感器，通過抗原與抗體之間的特性性結合，使得它具有高靈敏性、高選擇性、分析快速和操作簡便等優點。

????本發明采用FA@PANI@CS-HCl為基底材料，FA產生電化學信號，PANI提高電極表面的導電性和比表面積，從而利用CS-HCl良好的成膜性，實現了基底材料FA@PANI@CS-HCl對電極的良好修飾，實現了其對免疫分子的成功固定，增強了傳感器的靈敏度，擴寬了線性范圍，有效地降低了傳感器的檢出限，并可用于多種腫瘤標志物的分析。該方法具有成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速等優點，而且制備過程較為簡單，有效克服了目前腫瘤標志物檢測方法的不足。

發明內容

本發明的目的之一是基于酸中心復合物FA@PANI@CS-HCl為基底材料，構建了一種無酶，無標記的快速超靈敏的電化學免疫傳感器。

本發明的目的之二就是將Ag@Co₃O₄用于孵化抗體，實現了對腫瘤標志物的高靈敏檢測。

本發明的目的之三就是將該無標記電化學免疫傳感器用于多種腫瘤標志物的檢測。

本發明的技術方案如下：

1.一種基于酸中心復合物的免疫傳感器的制備方法

（1）將直徑為4?mm的玻碳電極用Al₂O₃拋光粉打磨，超純水清洗干凈；將6?μL、0.5?~?2?mg/mL?酸中心復合物FA@PANI@CS-HCl分散液滴加到電極表面，室溫下晾干成膜；?

（2）依次滴加6?μL的EDC/NHS溶液、6?μL的Ab-Ag@Co₃O₄抗體孵化物溶液于電極表面，超純水沖洗，4℃冰箱中晾干；所述EDC/NHS溶液是由0.1?mol/L?的EDC和0.1?mol/L?的NHS按照1?~?4?:?1的體積比混合制得；

（3）滴加6?μL、質量分數為0.5%?~?2%的BSA溶液于電極表面，封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4℃冰箱中晾干；

（4）滴加6?μL、0.0001~2?ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原標準溶液至電極表面，超純水沖洗，4℃冰箱中晾干，制得一種基于酸中心復合物的免疫傳感器。

2.?酸中心復合物FA@PANI@CS-HCl分散液的制備

將0.4~2.0?mg的二茂鐵甲酸FA與0.4~2.0?mg的鹽酸摻雜的聚苯胺PANI混合，分散于1?mL、0.5~10?mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽CS-HCl水溶液中，震蕩超聲24?h，混合均勻。

3.?Ab-Ag@Co₃O₄抗體孵化物溶液的制備?

（1）Co₃O₄納米片的制備

在磁力攪拌下，將2.0~3.0?g的CoCl₂·6H₂O溶于50~70?mL?超純水中，制得CoCl₂水溶液；將20?mL、0.1~1.0?mol/L?NaOH水溶液逐滴加入到CoCl₂水溶液中，繼續攪拌5?min，得到棕色沉淀，離心，用超純水和無水乙醇分別洗滌3次，在60?℃真空干燥箱中干燥12?h，制得固體沉淀物，將其在300~500℃下煅燒1?h，逐漸降到室溫，制得Co₃O₄納米片；