[發(fā)明專利]一種檢測(cè)融合基因AML1-ETO mRNA表達(dá)的試劑盒及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410455526.9
• 申請(qǐng)日: 2014-09-09
• 公開（公告）號(hào): CN104195255A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐偉杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州藍(lán)吉生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)融合基因AML1-ETO?mRNA表達(dá)的試劑盒，特別是涉及以一步 法Real-Time?qPCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)快速、定量檢測(cè)融合基因 AML1-ETO?mRNA的試劑盒，本發(fā)明還提出了上述檢測(cè)融合基因AML1-ETO?mRNA表達(dá) 的試劑盒的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

AML1-ETO基因融合是由t(8；21)(q22；q22)染色體易位而形成的，其編碼的蛋白產(chǎn)物 為一種多功能蛋白質(zhì)，可通過影響細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)和靶分子而參與細(xì)胞的分化與 增值、細(xì)胞凋亡以及自我更新等過程，在t(8；21)(q22；q22)染色體易位陽性的急性髓系白 血病(AML)特別是AML-M2型白血病的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。 (t(8；21)(q22；q22)易位)占AML的20％-40％，特別是在兒童FAB-M2中多見。 t(8；21)(q22；q22)易位引起AML1基因(acute?myeloblastic?leukemia?one?gene)和ETO基因 (eight?twenty?one?gene，也稱為MTG8基因)的融合。AML1基因斷裂點(diǎn)在第5、6外顯子 之間，ETO斷裂點(diǎn)在第2外顯子的上游，AML1第5外顯子和ETO第2外顯子融合形成 AML1/ETO基因，目前尚未發(fā)現(xiàn)AML1/ETO其他斷裂點(diǎn)引起的轉(zhuǎn)錄本。t(8；21)(q22；q22) 陽性是預(yù)后好的標(biāo)志，其完全緩解(CR)率可達(dá)90％，5年長(zhǎng)期無病生存率(event-free?survival, EFS)可達(dá)50％-70％。目前常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要包括染色體核型分析、FISH、PCR 檢測(cè)等。

Real-TimePCR技術(shù)是今年來發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有核電偶聯(lián) 裝置(CCD)的PCR擴(kuò)增儀，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的 擴(kuò)增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信 號(hào)，并通過軟件分析匯總到工作站得到擴(kuò)增曲線。一步法Real-Time?RT-PCR技術(shù)是 Real-Time?PCR的一種(Yuqi?Z,Min?Y,Johann?WM,et?al.2002.Quantification?of?human? Immunodeficiency?Virus?Type?1?Proviral?DNA?by?Using?TaqMan?Technology.J?Cli? Microbiol.40(2)：675-678；Drosten?C,Seifried?E,Roth?WK,et?al.2001.TaqMan?5-nuclease? human?immunodeficiency?virus?type?1?PCR?assay?with?phage-packaged?competitive?internal? control?for?high-throughput?blood?donor?screening.J?Clin?Microbiol,39:4302-4308；Schuurman? R,Descamps?D,Weverling?GJ,et?al.Multicenter?comparison?of?three?commercial?methods?for? quantification?of?human?immunodeficiency?virus?type?1?RNA?in?plasma.J?Clin?Microbiol.1996? Dec；34(12):3016-22；Christopherson?C,Kidane?Y,Conway?B,et?al.PCR-Based?assay?to? quantify?human?immunodeficiency?virus?type?1?DNA?in?peripheral?blood?mononuclear?cells.J? Clin?Microbiol.2000?Feb；38(2):630-4.)，它是一種直接快速檢測(cè)RNA的方法，與檢測(cè)DNA 的Real-Time?PCR相比，不同之處在于前者在反應(yīng)體系中增加了逆轉(zhuǎn)錄酶，同時(shí)多了一個(gè) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟；相同之處在于兩者在反應(yīng)體系中均有一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和 淬滅基團(tuán)的探針，探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán)，呈現(xiàn) 淬滅效應(yīng)。如果擴(kuò)增過程中有靶序列的存在，擴(kuò)增的過程中探針分子逐漸被水解切斷，熒 光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā) 出熒光信號(hào)。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。