[發明專利]基于ABCC3基因的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的檢測方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201410455046.2
• 申請日: 2014-09-09
• 公開（公告）號: CN104178578B
• 公開（公告）日: 2017-06-09
• 發明（設計）人: 張友軍;郭兆將;康師;朱勛;吳青君;王少麗;徐寶云;謝文
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所11039
• 代理人: 劉江良

技術領域

本發明涉及生物領域，尤其涉及小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的實時熒光定量PCR檢測方法及其試劑盒。

背景技術

小菜蛾Plutella xylostella (L.)，屬鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是一種世界性危害的重要蔬菜害蟲，寄主多達40種以上，現已成為世界范圍內十字花科蔬菜生產的重大障礙。小菜蛾主要以幼蟲在十字花科蔬菜的整個生長期危害葉片，大大降低了蔬菜的產量和質量，個別田塊嚴重發生時能減產90%以上，甚至絕產。小菜蛾之所以危害如此嚴重主要是因為對化學農藥具有超強的適應性。目前，它幾乎對用于防治其危害的各類殺蟲劑都產生了不同程度的抗藥性，這主要包括有機磷類、有機氯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、昆蟲生長發育調節劑以及生物源農藥阿維菌素、多殺菌素和蘇云金芽孢桿菌Bt等五十多種殺蟲劑 (唐振華和周成理，1992)。

蘇云金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis，簡稱Bt) 是一種可產生殺蟲晶體蛋白 (Insecticidal Crystal Proteins，簡稱ICPs，又被稱為δ-內毒素) 的革蘭氏陽性細菌。Bt很早即作為生物殺蟲劑被廣泛用于田間害蟲防治，Bt制劑現已成為世界上應用最廣的一類微生物殺蟲劑。但是Bt制劑大量及不合理的使用最終造成了害蟲產生Bt抗性。目前在世界范圍內至少已有7種害蟲被報道已經在田間產生Bt抗性，這其中包括2種害蟲對Bt制劑產生抗性以及5種害蟲對Bt作物產生抗性 (Tabashnik et al., 2011; Tabashnik et al., 2013)。由此可知，小菜蛾的Bt抗性問題已非常突出，因此為了更有效的使用Bt生物農藥防治小菜蛾，開發有效地小菜蛾Bt抗性早期快速分子診斷技術就顯得尤為重要。目前，盡管一些基于PCR方法的分子標記技術如RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA)、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態性) 已經用于小菜蛾抗性相關基因的尋找上，但這些標記并未直接用于小菜蛾抗性檢測，小菜蛾Bt抗性檢測仍局限于生物測定方法。然而，傳統的生物測定方法有一些缺點：(1)靈敏度低：生物測定很難檢測早期抗性或低頻率抗性；(2)周期長：小菜蛾的Bt生物測定結果一般需要2天 (48小時) 以上；(3)對試蟲數量要求很大：測定一個標準曲線完成一次生測至少需要約200頭試蟲，且對昆蟲飼養的要求也很高。(4)操作麻煩且標準性不強：方法比較繁瑣，操作起來比較復雜，從蟲源、飼養到測定難以做到真正的標準化，尤其要求試蟲的大小一致，不僅導致生測的工作量加大，而且諸多人為因素也會影響生測結果；(5)傳統的方法從軟件繪出的標準曲線求出的LC₅₀和 LC₉₀值的重復性和精確性較低；(6)傳統的生物測定方法對供試昆蟲測得的抗性水平往往具有滯后性。

隨著分子生物學技術進一步的飛速發展，人們已經將實時熒光定量PCR 技術 (Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR) 廣泛應用于多種病毒、細菌的抗藥性檢測，并開始應用于轉錄水平上昆蟲Bt抗藥性靶標基因的表達量檢測。實時熒光定量PCR就是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值(每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數)和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。相對于生測等常規Bt抗性檢測手段，實時熒光定量PCR具有操作簡單，靈敏度高，重復性好等優點，因而已開始成為昆蟲抗藥性靶標基因轉錄水平表達量檢測的首選方法，在抗藥性檢測上日益顯示出強大的優勢。