[發明專利]基于ABCC3基因的小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的檢測方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201410455046.2
• 申請日: 2014-09-09
• 公開（公告）號: CN104178578B
• 公開（公告）日: 2017-06-09
• 發明（設計）人: 張友軍;郭兆將;康師;朱勛;吳青君;王少麗;徐寶云;謝文
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所11039
• 代理人: 劉江良

1.一種用于檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的PCR引物對，其特征在于：

所述引物對的序列為：正向引物如SEQ ID NO.2所示，反向引物如 SEQ ID NO.3所示。

2.一種用于檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的PCR檢測試劑盒，其特征在于：

所述試劑盒包含權利要求1所述的引物對。

3.一種檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的PCR檢測方法，其特征在于：

其采用如權利要求1所述的引物對或權利要求2所述的試劑盒進行PCR，具體包括以下步驟：

(1)提取待測小菜蛾的RNA樣品，并反轉錄為cDNA模板；

(2)將所述cDNA模板加入到含有所述引物對的PCR反應液中得到PCR反應體系；

(3)進行實時熒光定量PCR檢測；

其中，PCR過程完成后，按0.l℃·s^-1的升溫速率從72℃升至95℃進行融解曲線的分析驗證，具體過程為：95℃進行15 s，然后60℃進行1 min，接著95℃進行30 s，最后再在60℃進行15 s；

若所述待測小菜蛾的樣品產生典型的“S”型擴增曲線及單峰融解曲線，且△Ct值≥7，則說明所述小菜蛾待測的樣品對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac產生抗性；若△Ct值≤6，則說明待測小菜蛾的樣品未對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac產生抗性，其中△Ct值就是靶標基因ABCC3與內參基因L32之間的Ct值的差值。

4.如權利要求3所述的檢測小菜蛾對Bt殺蟲蛋白Cry1Ac抗性的PCR檢測方法，其中，所述實時熒光定量PCR檢測的擴增程序為：94℃預變性15 min，94℃變性15 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸32 sec，40個循環。

5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述待測小菜蛾的RNA樣品為小菜蛾4齡幼蟲中腸的RNA樣品。