[發(fā)明專利]一種制備葡萄糖氧化酶的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410452283.3
• 申請日: 2014-09-05
• 公開（公告）號: CN104164411A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊洋;趙芬芬;葉琴;胡振興;馬萬良
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12R1/80
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11279
• 代理人: 王正茂

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用橘青霉固體發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

葡萄糖氧化酶(β-D-葡萄糖；EC1.1.2.3.4)能催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸，利用分子氧作為過氧化氫的電子受體。葡萄糖氧化酶用途較廣，它在食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。國內(nèi)外葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)多是利用黑曲霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)，但從黑曲霉中提取的葡萄糖氧化酶為胞內(nèi)酶，需要進(jìn)行破壁處理，造成了酶活力的損失、純化過程復(fù)雜等缺點。為了克服上述問題，本發(fā)明采用橘青霉固體發(fā)酵制備胞外葡萄糖氧化酶，工藝簡單、易操作、收率高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用橘青霉(Penicillium?citrinum?Thom.)固態(tài)發(fā)酵制備葡萄糖氧化酶的方法，該方法可以快速分離得到大量高活力的胞外葡萄糖氧化酶，為葡萄糖氧化酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明技術(shù)方案和實施例中所用橘青霉CICC40277由申請人自中國工業(yè)菌種微生物保藏中心購買。本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是：

一種制備葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟：

(1)以橘青霉CICC40277為出發(fā)菌株，用無菌水洗脫，稀釋得到橘青霉孢子懸液；

(2)挑取步驟(1)獲得的橘青霉孢子懸液接種于斜面培養(yǎng)基，置于恒溫箱中放大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：28～32℃，2～5天；

(3)將步驟(2)培養(yǎng)得到菌種用無菌水進(jìn)行洗脫，得到孢子懸浮液；

(4)挑取步驟(2)獲得孢子懸浮液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10％～20％(v/v)，將固體發(fā)酵培養(yǎng)基置于搖床中震蕩培養(yǎng)，得到葡萄糖氧化酶發(fā)酵液；

(5)將發(fā)酵液先進(jìn)行離心、超濾濃縮除鹽，得到葡萄糖氧化酶粗酶液；

(6)將步驟(5)所得粗酶液經(jīng)甲醇、丙酮相結(jié)合二次沉淀，過濾，濾餅凍干，即得到葡萄糖氧化酶制品。

作為優(yōu)選，步驟(2)所述斜面培養(yǎng)基成分為：蔗糖30g/L，硝酸鈉3g/L，七水合硫酸鎂0.5g/L，氯化鉀0.5g/L，四水合硫酸亞鐵0.01g/L，磷酸氫二鉀1g/L，瓊脂15g/L，余量為蒸餾水，PH6.5。

作為優(yōu)選，步驟(4)所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：甘蔗渣5～10g/L，酵母粉2～4g/L,硫酸鎂0.3～1g/L，磷酸二氫鈉2～4g/L,氯化鉀0.2～0.5g/L，碳酸鈣25～35g/L。

作為最佳優(yōu)選，步驟(4)所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：甘蔗渣5g/L，酵母粉2g/L,硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鈉2g/L,氯化鉀0.3g/L，碳酸鈣30g/L。

作為最佳優(yōu)選，步驟(4)所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：甘蔗渣10g/L，酵母粉2g/L,硫酸鎂0.8g/L，磷酸二氫鈉2g/L,氯化鉀0.2g/L，碳酸鈣30g/L。

作為優(yōu)選，步驟(4)搖床工作參數(shù)為溫度在28～35℃，轉(zhuǎn)速在180～220rpm。

作為最佳優(yōu)選，步驟(4)搖床工作參數(shù)為溫度在35℃，轉(zhuǎn)速在200rpm。

作為最佳優(yōu)選，步驟(4)搖床工作參數(shù)為溫度在28℃，轉(zhuǎn)速在200rpm。

作為優(yōu)選，步驟(4)搖床震蕩時間為2～5天。

作為最佳優(yōu)選，步驟(4)搖床震蕩時間為2天。

作為最佳優(yōu)選，步驟(4)搖床震蕩時間為3天。

作為最佳優(yōu)選，步驟(5)離心的工作參數(shù)為8000rpm，20min。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其進(jìn)步和創(chuàng)新之處在于：

(1)本發(fā)明研究了固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外葡萄糖氧化酶的性質(zhì)，為胞外葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)提供參考。

(2)在提取葡萄糖氧化酶過程中對酶的提取、純化工藝進(jìn)行了改進(jìn)，既提高了酶的比活力，又降低了提取過程中酶活的損失。

(3)本發(fā)明采用甘蔗渣作為發(fā)酵培養(yǎng)基的成分，既充分利用資源，變廢為寶，又節(jié)省成本，符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。

具體實施方式

結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。下列兩個實施例中所用橘青霉CICC40277由申請人自中國工業(yè)菌種微生物保藏中心購買。

實施例1