[發(fā)明專利]一種30分鐘內(nèi)提取土壤微生物基因組DNA的試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410449878.3
• 申請(qǐng)日: 2014-09-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104178481A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王清水;余彥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 林文弘

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供一種30分鐘內(nèi)提取土壤微生物基因組DNA的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

土壤除了為陸生植物提供營(yíng)養(yǎng)源和水分之外，還是植物生長(zhǎng)，進(jìn)行光合作用、能量交換的主要場(chǎng)所；同時(shí)也具有微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的一切營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及各種條件，是微生物良好的生活場(chǎng)所，有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱。

土壤是微生物的主要棲息地，是自然環(huán)境中最復(fù)雜的異質(zhì)體系，這決定了土壤微環(huán)境的多樣化和土壤微生物的高度多樣性。每克土壤含有大約10⁷個(gè)原核生物細(xì)胞，但僅有0.1%～10%的土壤微生物是可以培養(yǎng)的。在微生物學(xué)研究領(lǐng)域中，因?yàn)?9%以上的微生物都是目前未(難)被純培養(yǎng)的，過(guò)去人們對(duì)微生物世界的認(rèn)識(shí)基本上都集中在不到1%的微生物上。對(duì)這些未培養(yǎng)微生物多樣性及群落功能的研究將大大擴(kuò)展我們對(duì)生命的了解，包括了解生命如何耐受極端環(huán)境、新的生物能源、生命進(jìn)化以及微生物與環(huán)境之間的相互作用。

微生物環(huán)境基因組學(xué)為最大限度地挖掘微生物資源帶來(lái)了前所未有的機(jī)遇，已經(jīng)成為國(guó)際生命科學(xué)技術(shù)研究和開(kāi)發(fā)最重要的熱點(diǎn)和前沿。為了充分認(rèn)識(shí)不可培養(yǎng)微生物的豐富資源，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已建立起了許多不需要對(duì)微生物進(jìn)行獨(dú)立培養(yǎng)的新方法和新技術(shù)。如變性梯度凝膠電泳(DGGE)法是將目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的組成信息；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)是應(yīng)用不同的隨機(jī)引物在非嚴(yán)格的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)分析PCR產(chǎn)物在凝膠電泳上的條帶多態(tài)性來(lái)反映樣品中微生物的多樣性。

關(guān)于土壤微生物基因組學(xué)技術(shù)的構(gòu)建已有許多研究報(bào)道，主要的突破在于需要足夠高質(zhì)量的DNA，因此直接從土壤環(huán)境中提取和純化DNA是其中最關(guān)鍵的步驟。土壤微生物基因組學(xué)技術(shù)在我國(guó)土壤及環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)方面的研究才剛起步，對(duì)這一新技術(shù)的跟蹤和應(yīng)用，將會(huì)有力地促進(jìn)我國(guó)土壤微生物生態(tài)學(xué)研究的發(fā)展。因此，研究一種高效提取土壤微生物基因組DNA的試劑盒，對(duì)于大規(guī)模開(kāi)展土壤微生物基因組學(xué)研究顯得十分必要。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明提供一種30分鐘內(nèi)提取土壤微生物基因組DNA的試劑盒，利用該試劑盒能夠高效、快速提取土壤微生物DNA，所提取得到的DNA純度高、濃度高。

一種三十分鐘內(nèi)快速提取土壤微生物基因組DNA的試劑盒，所述試劑盒包括：

（1）Buffer?A溶液的配置：pH=5-6、0.5-2M?Tris-HCl?；

（2）Buffer?B溶液的配置：0.1-0.3M?Al₂(SO₄)_3?；

（3）Buffer?C溶液的配置：3-5M?NaOH；

（4）Buffer?D溶液的配置：pH=7-9、0.1-0.2M?Tris-HCl；

（5）Buffer?E溶液的配置：300-350μl、10wt.%SDS；

（6）Buffer?F溶液的配置：稱取2-3g?LiCl，1-2g?Tris，3-4g?EDTA，加入雙蒸水溶解并調(diào)節(jié)至pH=7.5-8.5，定容至100ml；

（7）去蛋白液溶液配制：4-6M鹽酸胍，15-25?mM?Tris-HCl，pH6.5-7.0，使用前加入乙醇，乙醇濃度為35-40wt.％；

（8）漂洗液溶液配制：15-25mM?NaCl，1-3mM?Tris-HCl，pH7.0-8.0；

（9）洗脫液溶液配制：5-15mM?Tris-HCl，pH8.0-9.0。

上述試劑盒的優(yōu)選配方：

（1）Buffer?A溶液的配置：pH=5.5、1M?Tris-HCl?；

（2）Buffer?B溶液的配置：0.2M?Al₂(SO₄)_3?；

（3）Buffer?C溶液的配置：4M?NaOH；

（4）Buffer?D溶液的配置：pH=8、0.1M?Tris-?Tris-HCl；

（5）Buffer?E溶液的配置：325μl、10%SDS；

（6）Buffer?F溶液的配置：稱取2.416g?LiCl，1.211g?Tris，3.506g?EDTA，加入雙蒸水溶解并調(diào)節(jié)至pH=8.0，定容至100ml；

（7）去蛋白液溶液配制：5M鹽酸胍，20?mM?Tris-HCl，pH6.6，使用前加入乙醇，乙醇濃度為38wt.％；