[發明專利]一種30分鐘內提取土壤微生物基因組DNA的試劑盒

在審

• 申請號: 201410449878.3
• 申請日: 2014-09-05
• 公開（公告）號: CN104178481A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 王清水;余彥
• 申請（專利權）人: 福建師范大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 林文弘

技術領域

本發明提供一種30分鐘內提取土壤微生物基因組DNA的試劑盒，屬于生物技術領域。

技術背景

土壤除了為陸生植物提供營養源和水分之外，還是植物生長，進行光合作用、能量交換的主要場所；同時也具有微生物生長繁殖所需要的一切營養物質及各種條件，是微生物良好的生活場所，有“微生物的天然培養基”之稱。

土壤是微生物的主要棲息地，是自然環境中最復雜的異質體系，這決定了土壤微環境的多樣化和土壤微生物的高度多樣性。每克土壤含有大約10⁷個原核生物細胞，但僅有0.1%～10%的土壤微生物是可以培養的。在微生物學研究領域中，因為99%以上的微生物都是目前未(難)被純培養的，過去人們對微生物世界的認識基本上都集中在不到1%的微生物上。對這些未培養微生物多樣性及群落功能的研究將大大擴展我們對生命的了解，包括了解生命如何耐受極端環境、新的生物能源、生命進化以及微生物與環境之間的相互作用。

微生物環境基因組學為最大限度地挖掘微生物資源帶來了前所未有的機遇，已經成為國際生命科學技術研究和開發最重要的熱點和前沿。為了充分認識不可培養微生物的豐富資源，結合現代分子生物學技術的發展，已建立起了許多不需要對微生物進行獨立培養的新方法和新技術。如變性梯度凝膠電泳(DGGE)法是將目標基因進行PCR擴增,通過對PCR產物進行分離和鑒定分析土壤微生物群落結構的組成信息；隨機擴增多態性DNA技術(RAPD)是應用不同的隨機引物在非嚴格的條件下進行PCR擴增，通過分析PCR產物在凝膠電泳上的條帶多態性來反映樣品中微生物的多樣性。

關于土壤微生物基因組學技術的構建已有許多研究報道，主要的突破在于需要足夠高質量的DNA，因此直接從土壤環境中提取和純化DNA是其中最關鍵的步驟。土壤微生物基因組學技術在我國土壤及環境微生物生態學方面的研究才剛起步，對這一新技術的跟蹤和應用，將會有力地促進我國土壤微生物生態學研究的發展。因此，研究一種高效提取土壤微生物基因組DNA的試劑盒，對于大規模開展土壤微生物基因組學研究顯得十分必要。

發明內容：

本發明提供一種30分鐘內提取土壤微生物基因組DNA的試劑盒，利用該試劑盒能夠高效、快速提取土壤微生物DNA，所提取得到的DNA純度高、濃度高。

一種三十分鐘內快速提取土壤微生物基因組DNA的試劑盒，所述試劑盒包括：

（1）Buffer?A溶液的配置：pH=5-6、0.5-2M?Tris-HCl?；

（2）Buffer?B溶液的配置：0.1-0.3M?Al₂(SO₄)_3?；

（3）Buffer?C溶液的配置：3-5M?NaOH；

（4）Buffer?D溶液的配置：pH=7-9、0.1-0.2M?Tris-HCl；

（5）Buffer?E溶液的配置：300-350μl、10wt.%SDS；

（6）Buffer?F溶液的配置：稱取2-3g?LiCl，1-2g?Tris，3-4g?EDTA，加入雙蒸水溶解并調節至pH=7.5-8.5，定容至100ml；

（7）去蛋白液溶液配制：4-6M鹽酸胍，15-25?mM?Tris-HCl，pH6.5-7.0，使用前加入乙醇，乙醇濃度為35-40wt.％；

（8）漂洗液溶液配制：15-25mM?NaCl，1-3mM?Tris-HCl，pH7.0-8.0；

（9）洗脫液溶液配制：5-15mM?Tris-HCl，pH8.0-9.0。

上述試劑盒的優選配方：

（1）Buffer?A溶液的配置：pH=5.5、1M?Tris-HCl?；

（2）Buffer?B溶液的配置：0.2M?Al₂(SO₄)_3?；

（3）Buffer?C溶液的配置：4M?NaOH；

（4）Buffer?D溶液的配置：pH=8、0.1M?Tris-?Tris-HCl；

（5）Buffer?E溶液的配置：325μl、10%SDS；

（6）Buffer?F溶液的配置：稱取2.416g?LiCl，1.211g?Tris，3.506g?EDTA，加入雙蒸水溶解并調節至pH=8.0，定容至100ml；

（7）去蛋白液溶液配制：5M鹽酸胍，20?mM?Tris-HCl，pH6.6，使用前加入乙醇，乙醇濃度為38wt.％；