[發明專利]促進轉煙草促早花基因NtFT5煙草生根的培養基及獲得短周期煙草的方法

有效

• 申請號: 201410449758.3
• 申請日: 2014-09-04
• 公開（公告）號: CN104195097B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發明（設計）人: 王根洪;夏慶友;王佩;高軍平;熊海軍
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司11275
• 代理人: 王貴君

技術領域

本發明屬于植物組織培養技術領域，涉及促進轉煙草促早花基因NtFT5煙草生根的培養基，還涉及利用該培養基獲得周期煙草的方法。

背景技術

開花是作物生產中的一個重要的農藝性狀，其受自主信號途徑、光周期、春化途徑及植物激素赤霉素等信號途徑綜合影響。在擬南芥中，這些信號途徑均通過磷脂酰乙醇胺結合蛋白家族phosphatidylethanolamine-binding?protein(PEBP)family成員發揮調控作用。在眾多植物中，PEBP家族成員之間已進化為相互拮抗的三個亞家族，它們是FLOWERING?LOCUS?T(FT)、TERMINAL?FLOWER?1(TFL1)和MOTHER?OF?FT?AND?TFL1(MFT)。FT和MFT成員被認為主要是促進開花的亞家族。擬南芥中過表達FT成員FT、TSF和MFT成員均能促進擬南芥早花。

煙草作為一種模式生物，它具有最簡單的生長習性和最可靠的轉化過程。以煙草作為模式植物，研究次級代謝產物生物合成途徑、植物與細菌互作、植物與病蟲害互作、維管組織的形成以及花發育過程和花色均具有顯著優勢并已形成了研究特色。在眾多植物中，許多關于功能基因鑒定和順式作用因子的基因組研究均以煙草為受體植物。然而，煙草生育周期長已經成為煙草品種培育的主要限制因素。研究發現，擬南芥FT基因能縮短開花時間，還發現煙草NtFT4，NtFT5也能促進煙草早花，但是現有條件下，此基因轉化后植株盡管能在培養基上早花，但是花朵通常很快凋零，不能形成種子，不能生根，不能獲得穩定遺傳的短周期煙草苗。因此，急需一種能夠獲得穩定遺傳的、短周期轉基因煙草苗的方法，且獲得的轉基因煙草縮短開花時間，能夠生根并形成種子。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供促進轉煙草促早花基因NtFT5煙草生根的培養基；本發明的目的之二在于提供利用所述培養基獲得穩定遺傳的、短周期煙草的方法。

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：

1、促進轉煙草促早花基因NtFT5煙草生根的培養基，所述生根培養基為含0.1mg/L的NAA、pH為5.6～5.8的1/2MS固體培養基，所述1/2MS為大量元素減半的MS培養基。

優選的，所述生根培養基為1/2MS+0.1mg/L?NAA+30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，調節pH至5.8。

2、利用所述培養基獲得短周期煙草的方法，包括如下步驟：

A.以SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示序列為引物，煙草cDNA為模板進行PCR擴增，獲得煙草促早花基因NtFT5，將擴增獲得的煙草促早花基因NtFT5連入pCXSN載體Xcm?I酶切位點處，得NtFT5-pCXSN重組質粒；將所得NtFT5-pCXSN重組質粒轉化農桿菌，得含有NtFT5-pCXSN重組質粒的工程菌；

B.將步驟A所得工程菌采用葉盤法轉化煙草，在含1mg/L?6-BA，0.1mg/L?NAA30g/L蔗糖，8g/L瓊脂，pH為5.8的MS培養基上共培養3天，然后在1mg/L?6-BA，0.1mg/L?NAA，250mg/L羧芐青霉素，20mg/L潮霉素，30g/L蔗糖，8g/L瓊脂，pH為5.8的MS培養基上誘導抗性苗，然后利用PCR篩選含有潮霉素基因的植株，得T0代轉NtFT5基因煙草；

C.將步驟B所得T0代轉NtFT5基因煙草在所述的培養基上生根培養，生根后移栽至培養基質中培養至開花、結籽，將獲得的種子萌發后獲得短周期煙草。

優選的，步驟A中，所述PCR擴增的條件為95℃預變性3min；94℃變性30s，54.0℃退火45s，72℃延伸40s，循環35次；最后72℃后延伸10min。

優選的，步驟A中，所述農桿菌為LBA4404。

本發明的有益效果在于：本發明針對煙草轉促早花基因FLOWERING?LOCUS?T(FT)后，難以生根結子、無法獲得穩定遺傳的短周期煙苗后代的情況，在生根培養基及培養方法上進行了系統研究和優化，所得培養基生根率高，試管苗移栽成活率高，能產生可育性種子，成功獲得穩定遺傳的短周期煙苗后代，轉NtFT5基因煙苗的生命周期縮短至2.5個月，能夠滿足基因功能鑒定及煙草育種研究的需要，具有良好的應用前景。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：

圖1為NtFT5-pCXSN重組質粒示意圖。