[發明專利]一種克服菊芋莖尖超低溫保存后再生苗玻璃化的方法

有效

• 申請號: 201410449109.3
• 申請日: 2014-09-04
• 公開（公告）號: CN104255705A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 張金梅;陳曉玲;韓麗;盧新雄;辛霞;尹廣鹍;何娟娟
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00;A01H4/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及植物種質資源的小滴玻璃化法超低溫保存技術，具體地說，涉及一種克服菊芋莖尖超低溫保存后再生苗玻璃化的方法。

背景技術

菊芋(Helianthus?tuberous?L.)為菊科向日葵屬多年生草本植物，是一種生態經濟型植物，具有很高的經濟價值、藥用價值、觀賞價值和生態價值。因其地上似菊，地下似芋而得名。原產北美洲，在美國、加拿大、墨西哥等國廣泛分布。17世紀經歐洲傳入我國，在我國東北三省、內蒙古、河北、河南等省均有分布。菊芋為無性繁殖作物，其繁殖能力很強，地下塊莖以每年20倍以上的速度繁殖，我國西北地區菊芋已形成規模化生產。菊芋生態適應性很廣，有很強的抗逆性。耐寒、耐旱、耐鹽堿、防風治沙。菊芋塊根中含有豐富的菊粉，菊粉在食品中廣泛應用，可作為甜味增味劑，也是生產果糖的原料。菊芋被聯合國糧農組織稱為“21世紀人畜共用作物”。利用菊芋塊莖轉化成乙醇和生物燃料等生物能源可應用在化工、生物制藥、航天等領域。

植物種質資源的非原生境保存分為田間保存、試管苗保存和超低溫保存。菊芋種質資源目前采用非原生境保存中的田間保存和試管苗保存。由于菊芋地下塊莖容易受到病毒的侵害，使病毒大量積累，導致品種退化，產量降低，而城市土地開發、環境惡化也嚴重威脅菊芋種質資源的安全保存。試管苗保存雖然具有占地面積小、不易受自然災害和病原菌影響以及人力、財力投入少，便于種質資源交換及運輸等優點，但需要經常繼代更新，且經多次繼代培養后面臨發生退化現象或產生變異等威脅。現已證明，植物組織材料經一系列的超低溫保存步驟后，投入液氮保存(氣相液氮或液相液氮條件下)，經化凍后仍能在一定培養條件下再生出新的植株，并保持其遺傳穩定性。它避免了田間保存易受自然災害影響而導致種質丟失或毀滅，以及試管苗組織培養保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險。

莖尖超低溫保存方法成功標準在于，經一系列超低溫保存處理后，化凍后的莖尖在適宜條件下再生恢復培養后，需要直接成功再生成正常苗。然而經超低溫保存后再生恢復培養階段，容易出現玻璃化現象，出現玻璃化現象的莖尖即使膨大也不易形成再生苗，再生苗也容易死亡。玻璃化現象是指再生的苗成半透明狀，葉片呈淺綠色或黃綠色、葉片肥厚，易發生畸形、卷曲或皺縮，葉片脆弱易碎。從解剖學上看，葉片無功能性氣孔，由于保衛細胞的功能性失調不能關閉氣孔，玻璃化的葉片不具有柵欄組織，只有海綿組織。由于玻璃化的植株呼吸和光合作用功能不健全，玻璃化苗的分化能力低下，難以繼代培養繁殖，更難以移栽成活。

超低溫保存后玻璃化苗的產生與很多因素有關，與組織培養中試管苗的玻璃化現象相比，影響因素更為復雜，可能涉及超低溫保存過程中的各個關鍵步驟，也可能涉及再生恢復培養過程中的培養基和培養環境條件，如水分、光照、營養條件、激素水平等。超低溫保存過程涉及多個關鍵步驟，如預培養、裝載、PVS2玻璃化保護、化凍、洗滌等，莖尖等材料在超低溫保存過程中可能受到不同程度的滲透、脫水、化學毒害等脅迫，造成部分細胞失去活力或者受到不同程度的傷害。若經化凍、洗滌和再生培養后，一些關鍵細胞的傷害得到了修復，則有利于莖尖再生成苗。反之，則有可能發生玻璃化或形成愈傷等現象，不利于莖尖的成功再生。

菊芋莖尖按常規方法超低溫保存后，出現了嚴重的玻璃化現象。過去文獻報道的克服玻璃化現象的研究，多集中于克服或消除組織培養過程中的試管苗的玻璃化現象，對克服超低溫保存后的玻璃化現象研究較少。克服超低溫保存后的玻璃化現象是解決超低溫保存成功的關鍵環節之一。

發明內容

本發明的目的是提供一種克服菊芋莖尖超低溫保存后再生苗玻璃化的方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種克服菊芋莖尖超低溫保存后再生苗玻璃化的方法，所述方法包括以下步驟：

1)預培養：切取菊芋組培苗莖尖，在含有0.3-0.4mol/L果糖的MS液體培養基中，25℃暗培養2-3天；

2)裝載：預培養后的莖尖在含有2.0mol/L甘油和0.4mol/L果糖的MS液體培養基中25℃裝載30-40min；

3)PVS2玻璃化保護劑處理：裝載后的莖尖轉入改良的PVS2玻璃化保護劑中0℃脫水處理15-40min；

4)小滴玻璃化法超低溫保存：步驟3)處理后的莖尖置于鋁箔條上，向莖尖上滴加改良的PVS2玻璃化保護劑，使莖尖完全包裹于由保護劑形成的液滴中，將鋁箔條置于凍存管中，然后投入液氮中保存；

5)解凍和洗滌：從液氮中取出凍存管，將鋁箔條上的莖尖浸入含有1.2mol/L果糖的MS培養液中室溫解凍和洗滌；