[發明專利]一種克服菊芋莖尖超低溫保存后再生苗玻璃化的方法有效
| 申請號： | 201410449109.3 | 申請日： | 2014-09-04 |
| 公開（公告）號： | CN104255705A | 公開（公告）日： | 2015-01-07 |
| 發明（設計）人： | 張金梅;陳曉玲;韓麗;盧新雄;辛霞;尹廣鹍;何娟娟 | 申請（專利權）人： | 中國農業科學院作物科學研究所 |
| 主分類號： | A01N3/00 | 分類號： | A01N3/00;A01H4/00 |
| 代理公司： | 北京路浩知識產權代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君 |
| 地址： | 100081 北*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 克服 菊芋 超低溫 保存 再生 玻璃化 方法 | ||
1.一種克服菊芋莖尖超低溫保存后再生苗玻璃化的方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)預培養：切取菊芋組培苗莖尖，在含有0.3-0.4mol/L果糖的MS液體培養基中，25℃暗培養2-3天；
2)裝載：預培養后的莖尖在含有2.0mol/L甘油和0.4mol/L果糖的MS液體培養基中25℃裝載30-40min；
3)PVS2玻璃化保護劑處理：裝載后的莖尖轉入改良的PVS2玻璃化保護劑中0℃脫水處理15-40min；
4)小滴玻璃化法超低溫保存：步驟3)處理后的莖尖置于鋁箔條上，向莖尖上滴加改良的PVS2玻璃化保護劑，使莖尖完全包裹于由保護劑形成的液滴中，將鋁箔條置于凍存管中，然后投入液氮中保存；
5)解凍和洗滌：從液氮中取出凍存管，將鋁箔條上的莖尖浸入含有1.2mol/L果糖的MS培養液中室溫解凍和洗滌；
6)步驟5)處理后莖尖轉入恢復培養基中恢復培養；
其中，步驟3)和4)中所述改良的PVS2玻璃化保護劑為含有30％甘油、15％二甲基亞砜、15％乙二醇和0.4mol/L果糖的MS液體培養基。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)具體為：取4-5周苗齡的菊芋組培苗，逐層剝去外層葉片，至剩余1-2片葉原基包圍莖尖分生組織，切取1.5-2mm的莖尖，在含有0.4mol/L果糖的MS液體培養基中，60rpm，25℃暗培養2-3天。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中共洗滌2次，每次10min，用含有1.2mol/L果糖的MS培養液進行洗滌。
4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，步驟6)中所述恢復培養基為MS+0.1mg/L?GA3+15g/L蔗糖，培養條件為：于25℃培養箱中暗培養3-5天后，轉入正常光照條件下進行培養。
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