[發明專利]用于雙向電泳的小鼠精子總蛋白提取和分離方法

在審

• 申請號: 201410447375.2
• 申請日: 2014-09-04
• 公開（公告）號: CN104198248A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 楊志強;孫子龍;魏瑞芬;羅廣營;牛瑞燕;王金明;張建海;王俊東
• 申請（專利權）人: 山西農業大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N27/447
• 代理公司: 太原華弈知識產權代理事務所 14108
• 代理人: 李毅

技術領域

本發明屬于生殖生物學和疾病發病機制研究技術領域，具體涉及一種小鼠精子總蛋白提取以及雙向電泳的方法。

背景技術

隨著現代工業的發展，環境中的有毒有害物質增多。近年來，有毒有害物質對生殖系統的影響及其藥物研發已經成為研究熱點。精子是一種高度分化的細胞，是雄性動物的成熟生殖細胞。精子的主要功能是完成受精過程，使其種群延續。精子的形態結構和功能異常，既能影響精液的質量，又是雄性動物不育的重要原因之一。基因是動物的遺傳物質，其含量成分相對恒定；蛋白質是基因功能的執行者，同一動物體不同細胞內蛋白表達差異顯著。疾病的發生必然伴隨著蛋白質的改變，以小鼠為動物模型尋找毒物、藥物影響精子的關鍵蛋白和標志蛋白，對于疾病的診斷、病理的研究和藥物的篩選都具有重要意義。蛋白質本身的結構和活動規律，如表達量，蛋白質間相互作用，結構的變化以及蛋白修飾必須依賴蛋白質組學技術來解決。

蛋白質組學是繼基因組學、轉錄組學之后形成的交叉學科，主要是從整體水平研究細胞蛋白質的組成，結構及其自身特有的活動規律。雙向電泳是蛋白組學技術三大技術之一，是質譜技術、蛋白質信息學的上游技術。雙向電泳利用等電點和分子量兩個性質對蛋白質進行分離,可以使樣品中的數千種蛋白質得到很好的分離。而蛋白質的樣品制備與電泳條件的摸索是雙向電泳的關鍵步驟，?但是由于小鼠精子含量少，采集困難，細胞體積小，細胞質少，富含頂體蛋白酶,其蛋白樣品制備一直較為困難。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于雙向電泳的小鼠精子總蛋白提取和分離方法，采用該方法提取和分離的小鼠精子總蛋白樣品制備全、分離蛋白點多、重復性好、圖譜清晰，是一套適用于小鼠精子總蛋白組分析的雙向電泳技術。

為實現本發明目的，本發明采用的技術方案包括如下步驟：

（1）將成熟雄性小鼠斷頸處死，把兩側附睪尾及輸精管的精子沖出，-80℃保存備用；

（2）將（1）取得的精子在室溫解凍后，在4℃、12,000g條件下離心10?min沉淀精子；

（3）將（2）獲得的精子按照1.?5?×10⁷個精子/mL?Trizol液裂解，置于1.5ml?Ep管中，用200μl槍頭反復吹打沉淀至完全分散，然后在精子中首先加入20?μL?β-巰基乙醇(β-ME)?，?65?℃?水浴60?min，然后加入0.?2?mL氯仿，?振蕩20s，?28℃水浴鍋中孵育5?min，12?000g、4℃?離心15?min，得到分層的混合物，吸取分層混合物的下層500μl-700μl有機相轉移至新管中，加入無水乙醇0.?3?mL，?4℃、12,000g?離心5?min，?使其中的DNA?沉淀；

（4）取（3）離心后的上清部分500μl-700μl)轉移至2mL新管中，?加入1.5mL異丙醇，?振蕩30?s，在28℃?水浴鍋中孵育10?min，?12?000g、4?℃?離心10?min?沉淀蛋白，棄上清；加入2?mL?洗液，用200μl槍頭反復吹打10次，洗滌蛋白沉淀，28℃水浴鍋中孵育20?min，12?000?g、4?℃?離心5?min，棄上清，重復3?次；然后再用無水乙醇重復洗滌蛋白3?次，最后在室溫下干燥10-20?min，待無水乙醇揮發殆盡為止；

（5）將（4）制備的精子蛋白沉淀溶于50μl-100?μl樣品水化液中，加入400?μl丙酮，-20℃純化15min，4℃、12,000g離心5?min，棄上清，再加入樣品水化液50μl-100μl，在4?℃?下靜止12?h，然后在4?℃、12?000g離心10?min，棄不溶物，取上清，然后采用Bradford法對上清進行蛋白定量，重復3次，求平均值；

（6）根據（5）定量的蛋白濃度，計算出上樣200μg-500μg所需的（5）中蛋白提取樣品的體積，制備的蛋白提取樣品和樣品水化液加入聚焦盤中，使終體積在125μl-250μl之內，將膠條膠面朝下放入蛋白提取樣品溶液，加蓋礦物油3-5ml，充滿整個膠條槽，室溫下被動水化15小時后的膠條進行第一向等電聚焦電泳；

（7）經（6）處理后的膠條，加入2.5ml平衡緩沖液Ⅰ，水平搖動15min，加入2.5ml平衡緩沖液Ⅱ，水平搖動15min，然后將膠條轉移至12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠的上端，瓊脂糖封膠液封頂，加入封膠液去除氣泡后，進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，條件是：15mA?30min，20?mA?100min；

（8）經（7）處理后的膠條用純水洗3次，每次15min，然后用考馬斯亮藍染色液染色5h，再用超純水脫色3次；