[發(fā)明專利]用于雙向電泳的小鼠精子總蛋白提取和分離方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201410447375.2 | 申請日： | 2014-09-04 |
| 公開（公告）號： | CN104198248A | 公開（公告）日： | 2014-12-10 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 楊志強(qiáng);孫子龍;魏瑞芬;羅廣營;牛瑞燕;王金明;張建海;王俊東 | 申請（專利權(quán)）人： | 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | G01N1/28 | 分類號： | G01N1/28;G01N27/447 |
| 代理公司： | 太原華弈知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 14108 | 代理人： | 李毅 |
| 地址： | 030801 *** | 國省代碼： | 山西;14 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 用于 雙向 電泳 小鼠 精子 蛋白 提取 分離 方法 | ||
1.用于雙向電泳的小鼠精子總蛋白提取和分離方法，包括如下步驟：
（1）將成熟雄性小鼠斷頸處死，把兩側(cè)附睪尾及輸精管的精子沖出，-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>
（2）將（1）取得的精子在室溫解凍后，在4℃、12,000g條件下離心10?min沉淀精子；
（3）將（2）獲得的精子按照1.?5?×107個精子/mL?Trizol液裂解，置于1.5ml?Ep管中，用200μl槍頭反復(fù)吹打沉淀至完全分散，然后在精子中首先加入20?μL?β-巰基乙醇(β-ME)?，?65?℃?水浴60?min，然后加入0.?2?mL氯仿，?振蕩20s，?28℃水浴鍋中孵育5?min，12?000g、4℃?離心15?min，得到分層的混合物，吸取分層混合物的下層500μl-700μl有機(jī)相轉(zhuǎn)移至新管中，加入無水乙醇0.?3?mL，?4℃、12,000g?離心5?min，?使其中的DNA?沉淀；
（4）取（3）離心后的上清部分500μl-700μl轉(zhuǎn)移至2mL新管中，?加入1.5mL異丙醇，?振蕩30?s，在28℃?水浴鍋中孵育10?min，?12?000g、4?℃?離心10?min?沉淀蛋白，棄上清；加入2?mL?洗液，用200μl槍頭反復(fù)吹打10次，洗滌蛋白沉淀，28℃水浴鍋中孵育20?min，12?000?g、4?℃?離心5?min，棄上清，重復(fù)3?次；然后再用無水乙醇重復(fù)洗滌蛋白3?次，最后在室溫下干燥10-20?min，待無水乙醇揮發(fā)殆盡為止；
（5）將（4）制備的精子蛋白沉淀溶于50μl-100?μl樣品水化液中，加入400?μl丙酮，-20℃純化15min，4℃、12,000g離心5?min，棄上清，再加入樣品水化液50μl-100μl，在4?℃?下靜止12?h，然后在4?℃、12?000g離心10?min，棄不溶物，取上清，然后采用Bradford法對上清進(jìn)行蛋白定量，重復(fù)3次，求平均值；
（6）根據(jù)（5）定量的蛋白濃度，計算出上樣200μg-500μg所需的（5）中蛋白提取樣品的體積，制備的蛋白提取樣品和樣品水化液加入聚焦盤中，使終體積在125μl-250μl之內(nèi)，將膠條膠面朝下放入蛋白提取樣品溶液，加蓋礦物油3-5ml，充滿整個膠條槽，室溫下被動水化15小時后的膠條進(jìn)行第一向等電聚焦電泳；
（7）經(jīng)（6）處理后的膠條，加入2.5ml平衡緩沖液Ⅰ，水平搖動15min，加入2.5ml平衡緩沖液Ⅱ，水平搖動15min，然后將膠條轉(zhuǎn)移至12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠的上端，瓊脂糖封膠液封頂，加入封膠液去除氣泡后，進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，條件是：15mA?30min，20?mA?100min；
（8）經(jīng)（7）處理后的膠條用純水洗3次，每次15min，然后用考馬斯亮藍(lán)染色液染色5h，再用超純水脫色3次；
（9）將（8）制備的凝膠用圖像掃描儀掃描，即得電泳圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于雙向電泳的小鼠精子總蛋白提取和分離方法，其特征在于，所述的洗液為0.3?M?鹽酸胍或95%?乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于雙向電泳的小鼠精子總蛋白提取和分離方法，其特征在于，所述的樣品水化液是由下列原料的質(zhì)量體積份（w/v）組成：?7?M?尿素、2?M?硫脲、4%CHAPS、65?mM?DTT、0.2%?（w/v）Bio-Lyte、0.001%溴酚藍(lán)，且均各種成分需現(xiàn)用現(xiàn)配。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于雙向電泳的小鼠精子總蛋白提取和分離方法，其特征在于，所述的第一向等電聚焦電泳包括下列步驟：無電壓室溫被動水化15小時，250伏電壓線性除鹽2小時，500伏電壓快速除鹽0.5小時，4000伏電壓線性升壓3小時，4000伏電壓快速聚焦20000總電壓時間積，500伏電壓低壓維持0到12小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于雙向電泳的小鼠精子總蛋白提取和分離方法，其特征在于，所述的平衡緩沖液Ⅰ由6?M?尿素、2%SDS、0.375M?PH8.8?Tris-Hcl、20%?甘油、1%DTT配置而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于雙向電泳的小鼠精子總蛋白提取和分離方法，其特征在于，所述的平衡緩沖液Ⅱ由6?M?尿素、2%SDS、0.375M?PH8.8?Tris-Hcl、20%?甘油、2.5%碘乙酰胺配置而成。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于山西農(nóng)業(yè)大學(xué);，未經(jīng)山西農(nóng)業(yè)大學(xué);許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201410447375.2/1.html，轉(zhuǎn)載請聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
