[發明專利]一種煙草角斑病菌的分子鑒定引物及鑒定方法

有效

• 申請號: 201410445480.2
• 申請日: 2014-09-03
• 公開（公告）號: CN104212896A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 萬秀清;喬嬋;李若;李麗杰;王春軍;元野;賀國強;顏培強;李尊強;郭思達;孫宏偉;焦玉生;李恒全;邱恩建;劉德育;陳榮平;黃磊;張海霞;劉偉;魏繼承
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司黑龍江省公司牡丹江煙草科學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

技術領域

本發明涉及一種煙草角斑病菌的分子鑒定引物及鑒定方法，屬于植物病菌檢測領域。

背景技術

煙草是我國重要的經濟作物之一。煙草角斑病(Pseudomonas?syringae?pv.angulata)是煙草主要的細菌性病害，在我國北方煙區發生嚴重，每年均造成一定程度的危害和經濟損失。

傳統細菌的分類鑒定主要是基于形態學特征、致病性測定、生理生化特性等，工作繁瑣，時間長，鑒定時還易受人為及環境等諸多因素的干擾，而且不能直接從植物組織中檢測出病原菌，難以滿足病害控制中快速、靈敏、穩定的檢測要求，很容易錯過病害防治的最佳時期，而免疫血清學鑒定方法特異性較差，常常受到抗血清質量的影響，容易造成假陽性，因此這些方法的應用均受到一定的限制。目前，我國官方機構進行細菌鑒定過程中主要采用傳統的分類學鑒定以及生物學鑒定(16S?rRNA序列測定分析)相結合的方式，鑒定時間至少需要1個月以上，對于農業生產過程中所面臨的需要及時快速鑒定的病原菌，這些方法存在明顯的不足。隨著生物技術在病害鑒定方面開發應用及病菌DNA數據在基因庫中的不斷積累，使分子生物學方法鑒定細菌種類技術日趨完善和成熟。建立細菌的PCR特異鑒定引物，利用細菌分離培養技術及PCR技術，可以在(1-2)d內對初期侵染的細菌進行鑒定，從而指導煙農及時準確用藥，對保障我國煙葉生產具有重要的意義。

對于煙草角斑病的分子鑒定方法，河南農業大學的蔣世君等2010年申請了中國專利CN?101206193“快速檢測和鑒定煙草野火病菌和角斑病菌的方法”，該方法涉及的角斑病菌的PCR鑒定引物設計于hrpZ基因，且同時擴增出煙草野火病菌，也就是說不能有效區分野火病和角斑病或者其它丁香假單孢菌。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中煙草角斑病菌的生物學檢測方法特異性差、靈敏度低、周期長、血清學鑒定方法成本高并易造成假陽性等問題，提供煙草角斑病菌特異分子鑒定引物以及可靠、特異性強、靈敏度高的煙草角斑病菌快速分子鑒定的方法。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

基于煙草角斑病的AvrPphE基因區域設計合成了煙草角斑病菌特異的PCR鑒定引物，該引物可以特異鑒別煙草角斑病菌，煙草野火病菌、其它的丁香假單孢菌及煙草葉面分離的其它細菌分離物均擴增不出特異的條帶。

具體地，一組煙草角斑病菌的分子鑒定引物，如下：

上游引物YF1：5'-GCCCAGAACCCCGCTTCTTA-3'(SEQ?ID?NO：1)

下游引物YR2：5'-GGGTCAGAACGTTCTCGGCG-3'(SEQ?ID?NO：2)

煙草角斑病菌AvrPphE基因序列如序列表中的SEQ?ID?NO：3所示，本發明所述引物對煙草角斑病菌特異性擴增出763bp的產物。

本發明還提供了一種煙草角斑病菌的鑒定方法，該方法包括如下步驟：

(1)煙草角斑病細菌分離培養

用滅菌的剪刀將煙草角斑病疑似病葉病斑(1-2)cm剪下。超凈工作臺中，用70％乙醇對病斑進行表面消毒(30s-60s)，滅菌水漂洗(3-4)次，置于LB固體培養基中25℃下培養2-3天，收集病斑周圍長出的細菌菌落于無菌的1000mL的LB液體培養基中，混勻后，吸取100μL菌液涂LB固體平板，25℃下培養2-3天，挑取單菌落于100μL的LB液體培養基中，25℃下培養4h，用于PCR檢測。也可以直接用滅菌牙簽蘸取單菌落用于PCR檢測。

(2)煙草角斑病菌PCR擴增

在0.5mL的PCR管中加入10×PCR緩沖液(Buffer)1.0μL，加入10pmol/μL的YF1和YR2引物各0.5μL，加入2.5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，加入dNTPs?1μL，加入細菌菌液(或用滅菌牙簽蘸取的單菌落)1μL，加入超純水5.8μL。PCR擴增程序見表1。

表1?菌液(落)PCR反應條件

(3)PCR擴增產物分離及結果判別

將4μL?PCR擴增產物用1.5％瓊脂糖電泳分離，于紫外分析儀中根據擴增產物的大小判定結果。如果能特異性地擴增出763bp產物時，即可判斷所分離的細菌為煙草角斑病菌，否則所分離的細菌中未存在煙草角斑病菌。

本發明方法適用于植物組織中煙草角斑病菌的快速可靠的檢測和鑒定，對于農業生產中煙草角斑病菌引起的病害防治具有重要的實用價值。本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果：