[發(fā)明專利]用于測(cè)定食物樣品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(STEC)的存在或不存在的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410442833.3
• 申請(qǐng)日: 2014-09-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104419766B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: S·哈利爾-蘇里爾;Y·王;C·納許特;M·魯梅爾哈德;S·耶馬爾;S·布頓;V·V·威爾德
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 帕爾基因盤(pán)技術(shù)公司
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686;C12Q1/04;C12M1/34;C12M1/00;C12R1/19
• 代理公司: 中國(guó)國(guó)際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 袁泉

本發(fā)明涉及將在短時(shí)間段內(nèi)產(chǎn)生關(guān)于食物樣品中的致病性STEC(產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌)的存在或不存在的可靠結(jié)果的方法。該方法包括?使食物樣品在允許大腸桿菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中溫育，以獲得大腸桿菌儲(chǔ)液培養(yǎng)基；?執(zhí)行儲(chǔ)液培養(yǎng)基中的大腸桿菌裂解，以獲得包含大腸桿菌DNA的樣品溶液；和?使用擴(kuò)增下述大腸桿菌基因或其片段的引物，對(duì)樣品溶液實(shí)施第一系列的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)：分別編碼志賀毒素1和志賀毒素2的stx1和/或stx2，對(duì)于待測(cè)定的每個(gè)STEC血清群，編碼緊密粘附素的該血清群的eae基因的亞型，和對(duì)于待測(cè)定的每個(gè)STEC血清群，對(duì)于該血清群特異性的生物標(biāo)記基因；并且在第一系列的PCR中擴(kuò)增stx1和/或stx2以及至少一個(gè)血清群的eae基因和特異性生物標(biāo)記基因的情況下：?通過(guò)對(duì)大腸桿菌儲(chǔ)液培養(yǎng)基的濃縮物執(zhí)行第二系列的PCR，和任選地，對(duì)衍生自濃縮物的單一大腸桿菌菌落執(zhí)行第三系列的PCR，驗(yàn)證STEC的一個(gè)或多個(gè)特異性血清群的存在。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于測(cè)定食物樣品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Escherichia coli)(STEC)的存在或不存在的方法，在此類方法中使用的反應(yīng)盒，以及容納反應(yīng)盒的儀器。

發(fā)明背景

在STEC的菌株中，已鑒定了與人的嚴(yán)重疾病相關(guān)的七個(gè)血清群，即O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145。這些血清群在下文中被稱為STEC Top7。美國(guó)農(nóng)業(yè)部(UnitedStates Department of Agriculture)(USDA)已實(shí)施可應(yīng)用于某些生牛肉產(chǎn)品的分析的法規(guī)，該法規(guī)將除血清群O157之外的如上鑒定的六種其他血清群定義為摻雜物。

當(dāng)測(cè)定這些STEC菌株的存在或不存在時(shí)，通常將食物樣品加入允許大腸桿菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，以提供大腸桿菌儲(chǔ)液培養(yǎng)基。

隨后，儲(chǔ)液培養(yǎng)基中的大腸桿菌的裂解提供了包含大腸桿菌DNA的樣品溶液。

使用常規(guī)方法以可靠方式在樣品中對(duì)上述血清群的后續(xù)檢測(cè)是耗時(shí)操作。

在ISO13136技術(shù)規(guī)范(ISO/TS13136:2012)中闡述使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用于檢測(cè)主要STEC毒力基因stx1、stx2、eae和血清群特異性基因。PCR陽(yáng)性樣品必須通過(guò)培養(yǎng)方法加以證實(shí)，因?yàn)椴煌幕蚩梢詫儆诓煌木?，?dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

發(fā)明概述

本發(fā)明的目的是提供在更短的時(shí)間段內(nèi)產(chǎn)生關(guān)于食物樣品中致病性STEC的存在或不存在的可靠結(jié)果的方法。

這個(gè)目的通過(guò)如權(quán)利要求1中所述的方法得到解決。

令人驚訝的是，由于其特定的工作流程，根據(jù)本發(fā)明的方法允許假陽(yáng)性結(jié)果率的降低以及菌落分離的優(yōu)化。由此可以顯著簡(jiǎn)化食物樣品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(STEC)的一個(gè)或多個(gè)特異性血清群的存在或不存在的測(cè)定。

更具體而言，本發(fā)明提供了以非常有時(shí)間效率的方式用于鑒定和證實(shí)食物樣品中高致病性STEC的存在或不存在的方法，在所述方法中，通過(guò)使食物樣品在培養(yǎng)基中溫育而獲得大腸桿菌儲(chǔ)液培養(yǎng)基以及裂解儲(chǔ)液培養(yǎng)基中含有的大腸桿菌后，對(duì)這種含DNA的樣品溶液實(shí)施使用特異性引物的第一系列的PCR反應(yīng)。這可以稱為第一篩選步驟。該第一篩選步驟允許同時(shí)檢測(cè)編碼志賀毒素的stx1和/或stx2毒力基因、編碼與一個(gè)或多個(gè)血清群特異性相關(guān)的緊密粘附素(intimin)的eae亞型、以及每個(gè)血清群的生物標(biāo)記基因。

隨后，假定的陽(yáng)性標(biāo)品將必須加以證實(shí)。

eae亞型的檢測(cè)允許基本上減少假陽(yáng)性樣品的數(shù)目。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)陽(yáng)性樣品實(shí)施第二篩選步驟，其中衍生自大腸桿菌儲(chǔ)液培養(yǎng)基的免疫濃縮物再一次在PCR分析中進(jìn)行檢查。

在該第二篩選步驟獲得陽(yáng)性結(jié)果的情況下，將免疫濃縮物的部分在顯色培養(yǎng)基上鋪平板，以將各自STEC菌株分離為菌落。