[發明專利]用于測定食物樣品中產志賀毒素大腸桿菌(STEC)的存在或不存在的方法

有效

• 申請號: 201410442833.3
• 申請日: 2014-09-02
• 公開（公告）號: CN104419766B
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: S·哈利爾-蘇里爾;Y·王;C·納許特;M·魯梅爾哈德;S·耶馬爾;S·布頓;V·V·威爾德
• 申請（專利權）人: 帕爾基因盤技術公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/04;C12M1/34;C12M1/00;C12R1/19
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 袁泉

1.一種用于測定食物樣品中致病性產志賀毒素大腸桿菌(STEC)的一個或多個特異性血清群的存在或不存在的方法，其包括

-使所述食物樣品在允許大腸桿菌生長的培養基中溫育，以獲得大腸桿菌儲液培養基；

-執行所述儲液培養基中的大腸桿菌裂解，以獲得包含大腸桿菌DNA的樣品溶液；和

-使用擴增下述大腸桿菌基因或其片段的引物，對所述樣品溶液實施第一系列的聚合酶鏈式反應(PCR)：

●分別編碼志賀毒素1和志賀毒素2的stx1和/或stx2，

●對于待測定的每個STEC血清群，編碼緊密粘附素的該血清群的eae基因的亞型，和

●對于待測定的每個STEC血清群，對于該血清群特異性的生物標記基因；

并且在第一系列的PCR中擴增stx1和/或stx2以及至少一個血清群的所述eae基因和所述特異性生物標記基因的情況下：

-通過對大腸桿菌儲液培養基的濃縮物執行第二系列的PCR，和任選地，對衍生自所述濃縮物的單一大腸桿菌菌落執行第三系列的PCR，以驗證STEC的一個或多個特異性血清群的存在，

其中對STEC的一個或多個特異性血清群的存在的驗證包括

-使用針對所述各自血清群的STEC的抗體，執行關于每個血清群的所述大腸桿菌儲液培養基的免疫濃縮；

-從所述免疫濃縮物中分離DNA；和

-使用擴增下述大腸桿菌基因或其片段的引物，對所述DNA實施第二系列的PCR：

●stx1和/或stx2，

●所述各自血清群的eae基因的亞型，和

●任選地，對于所述各自血清群特異性的生物標記基因。

2.權利要求1的方法，其中在所述第二系列的PCR中擴增stx1和/或stx2以及eae基因的情況下，存在STEC的一個或多個特異性血清群的驗證進一步包括：

-在顯色培養基上鋪平板所述免疫濃縮物，以允許分離的大腸桿菌菌落的生長；

-從所述分離的菌落中分離DNA；和

-使用擴增下述大腸桿菌基因或其片段的引物，對所述DNA實施第三系列的PCR：

●stx1和/或stx2，

●所述各自血清群的eae基因的亞型，和

●任選地，對于所述各自血清群特異性的生物標記基因。

3.權利要求1或2的方法，其中用特異性標記的DNA探針執行所述系列的PCR，以允許檢測所述擴增的基因或片段。

4.權利要求1或2的方法，其中待測定的一個或多個特異性血清群選自O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145。

5.權利要求4的方法，其包括測定所有血清群O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145的存在或不存在。

6.權利要求4的方法，其中待在所述系列的PCR中擴增的所述eae基因的亞型選自關于O26的eaeβ，關于O145和O157的eaeγ，關于O45、O103和O121的eaeε，以及關于O111的eaeθ。

7.權利要求1或2的方法，其中所述特異性生物標記基因選自所述各自血清群的O-抗原轉運蛋白基因。

8.權利要求1或2的方法，其中所述食物樣品選自生肉、生乳制品或生蔬菜制品。

9.權利要求1或2的方法，其中所述食物樣品選自生牛肉或芽。

10.權利要求1或2的方法，其中用于所述溫育步驟的所述培養基選自緩沖蛋白胨水，任選包含吖啶黃素；和胰蛋白酶大豆培養湯，任選包含新生霉素。

11.權利要求1或2的方法，其中用于所述溫育步驟的所述培養基是經修飾的胰蛋白酶大豆培養湯，任選包含新生霉素。

12.權利要求1或2的方法，其中所述每個系列的PCR優選以自動化方式同時執行。

13.權利要求2的方法，其中所述顯色培養基選自頭孢克肟-亞碲酸鹽山梨糖醇麥康凱；含有新生霉素、頭孢克肟三水合物和亞碲酸鉀的改良彩虹瓊脂；胰蛋白胨膽汁X葡糖苷酸培養基；和頭孢克肟-亞碲酸鹽鼠李糖麥康凱。