[發明專利]同時檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的熒光探針PCR方法

有效

• 申請號: 201410441438.3
• 申請日: 2014-09-01
• 公開（公告）號: CN104164514A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 郭書林;陳信忠;賈鵬;龔艷清;楊俊萍;陳炳穎;孔繁德
• 申請（專利權）人: 廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及微生物的檢測方法和檢測試劑盒，具體涉及用于同時檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌實時熒光PCR檢測的引物和探針序列，以及試劑盒。

背景技術

遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella?sp.）廣泛分布于海水和淡水中，感染各種養殖水生動物，對水產養殖危害極大。對鰻魚、鯰魚、鱔魚和其他多種動物致病，可造成嚴重經濟損失，引起魚類發病的病原菌主要為遲緩愛德華氏菌（E.tarda）和鮰愛德華氏菌（E.ictaluri）。現已知遲緩愛德華氏?菌是多種淡、海水養殖魚類的重要病原菌，引起魚類腎臟、肝臟膿瘍病灶的疾病，損失嚴重，是目前水產養殖中危害較大的病原菌。

目前國內外建立的愛德華氏菌基因檢測技術有檢測遲緩愛德華氏菌的普通PCR檢測技術，以及檢測鮰愛德華氏菌的普通PCR檢測技術，這些方法需要多次才能把這兩種菌檢測出來，而且需要通過凝膠電泳才能觀察檢測結果，檢測方法較熒光PCR方法為繁瑣而費時。

目前國內外尚未開發建立同時檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的熒光探針PCR檢測方法。

發明內容

有鑒于此，本發明為了快速檢測水生動物中的遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌，開發建立了檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的實時熒光PCR方法。

本發明一方面開發了一種同時檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的熒光探針PCR檢測方法。

本發明另一方面提供一種用于同時檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的試劑盒。

一種同時檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的熒光探針PCR檢測方法，所述的方法包括：利用特異性探針和引物對，以細菌DNA為模板進行實時熒光PCR?反應，其特征在于:所述引物對分別為Seq?ID?No.1、Seq?IDNo.2、Seq?IDNo.3和Seq?IDNo.4?所示的序列；

Seq?ID?No.1:?5’-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’

Seq?ID?No.2:?5’-CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’

Seq?ID?No.3:?5’-TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’

Seq?ID?No.4:?5’-AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’

其中：Seq?ID?No.1為遲緩愛德華氏菌的上游引物，Seq?ID?No.2為遲緩愛德華氏菌的下游引物，Seq?ID?No.3為鮰愛德華氏菌的上游引物，Seq?ID?No.3為鮰愛德華氏菌的下游引物；

所述探針為能與遲緩愛德華氏菌或鮰愛德華氏菌的基因組DNA位于所述引物對之間的序列相同或互補的寡核苷酸序列，并且所述探針的5’端和3’端分別標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團；

優選的，所述探針為Seq?ID?No.5和Seq?ID?No.6所示的序列,

Seq?ID?No.5：5’-ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’；

Seq?ID?No.6：5’-CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’，

其中，Seq?ID?No.5為能與遲緩愛德華氏菌的基因組DNA位于所述引物對之間的序列相同或互補的寡核苷酸序列；Seq?ID?No.6為能與鮰愛德華氏菌的基因組DNA位于所述引物對之間的序列相同或互補的寡核苷酸序列。

所述Seq?ID?No.5探針5’端標記的熒光報告基團為FAM，Seq?ID?No.6探針5’端標記的熒光報告基團為VIC，所述探針3’端標記的熒光淬滅基團為TAMRA。

所述實時熒光PCR?反應的引物終濃度為0.25μmol/?dm³，探針終濃度為0.5μmol/?dm³。

所述實時熒光PCR?的反應條件包括：先95?℃變性1?min，然后95?℃?10?s、55℃10?s、68?℃?30?s循環40次，在68℃進行FAM和VIC雙通道熒光采集。

本發明另一方面提供一種用于同時檢測遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒含有能擴增出遲緩愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的基因片段的引物對，所述引物對分別為Seq?ID?No.1、Seq?IDNo.2、Seq?IDNo.3和Seq?IDNo.4?所示的序列；

Seq?ID?No.1:?5’-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’

Seq?ID?No.2:?5’-CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’