[發(fā)明專利]同時(shí)檢測(cè)遲緩愛(ài)德華氏菌和鮰愛(ài)德華氏菌的熒光探針PCR方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410441438.3
• 申請(qǐng)日: 2014-09-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104164514A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭書(shū)林;陳信忠;賈鵬;龔艷清;楊俊萍;陳炳穎;孔繁德
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種同時(shí)檢測(cè)遲緩愛(ài)德華氏菌和鮰愛(ài)德華氏菌的熒光探針PCR檢測(cè)方法，所述的方法包括：利用特異性探針和引物對(duì)，以細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR?反應(yīng)，其特征在于:所述引物對(duì)分別為Seq?ID?No.1、Seq?IDNo.2、Seq?IDNo.3和Seq?IDNo.4?所示的序列；

Seq?ID?No.1:?5’-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’

Seq?ID?No.2:?5’-CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’

Seq?ID?No.3:?5’-TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’

Seq?ID?No.4:?5’-AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’

所述探針為能與遲緩愛(ài)德華氏菌或鮰愛(ài)德華氏菌的基因組DNA位于所述引物對(duì)之間的序列相同或互補(bǔ)的核苷酸序列，并且所述探針的5’端和3’端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)；

所述探針為Seq?ID?No.5和Seq?ID?No.6所示的序列,

Seq?ID?No.5：5’-ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’

Seq?ID?No.6：5’-CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’。

2.根據(jù)權(quán)利要求1?所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述Seq?ID?No.5探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，Seq?ID?No.6探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC，所述探針3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。

3.根據(jù)權(quán)利要求1?或2?所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述實(shí)時(shí)熒光PCR?反應(yīng)的引物終濃度為0.25μmol/?dm³，探針終濃度為0.5μmol/?dm³。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述實(shí)時(shí)熒光PCR?的反應(yīng)條件包括：先95?℃變性1?min，然后95?℃?10?s、55℃10?s、68?℃?30?s循環(huán)40次，在68℃進(jìn)行FAM和VIC雙通道熒光采集。

5.一種用于同時(shí)檢測(cè)遲緩愛(ài)德華氏菌和鮰愛(ài)德華氏菌的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒含有能擴(kuò)增出遲緩愛(ài)德華氏菌和鮰愛(ài)德華氏菌的基因片段的引物對(duì)，所述引物對(duì)分別為Seq?ID?No.1、Seq?IDNo.2、Seq?IDNo.3和Seq?IDNo.4?所示的序列；

Seq?ID?No.1:?5’-CTGCCAAGCAGGGACGTAA-3’

Seq?ID?No.2:?5’-CGAGGAGAGCATCTTGTCGAA-3’

Seq?ID?No.3:?5’-TCCATTCGTCTGTGCGACAA-3’

Seq?ID?No.4:?5’-AAAACACGTTCGGATGGATTG-3’

所述探針為能與遲緩愛(ài)德華氏菌或鮰愛(ài)德華氏菌的基因組DNA位于所述引物對(duì)之間的序列相同或互補(bǔ)的核苷酸序列，并且所述探針的5’端和3’端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)；

所述探針為Seq?ID?No.5和Seq?ID?No.6所示的序列,

5’-ATCCTCAACGTCGAGAAGGCGCG-3’

5’-CACTATGAGGGTGGGATCAAGGCGTTT-3’。

6.根據(jù)權(quán)利要求5?所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述Seq?ID?No.5探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，Seq?ID?No.6探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為VIC，所述探針3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。