[發明專利]具有雙表達盒的谷氨酰胺合成酶高效表達載體

有效

• 申請號: 201410441296.0
• 申請日: 2014-09-02
• 公開（公告）號: CN104195173B
• 公開（公告）日: 2017-03-08
• 發明（設計）人: 胡品良;白潔;洪偉東;鄒敬;宋凌云;楊澤榮
• 申請（專利權）人: 北京比洋生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/52
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及生物制藥基因工程表達技術，具體涉及一種用于高表達細胞株開發的載體的構建及應用。

背景技術

誕生于70年代末的生物制藥因其具有其他藥物無法比擬的優點，已迅速成為制藥工業中一個引人矚目的領域。生物技術的主要應用領域是我國改善民生的重要組成部分，我國龐大的人口基數和巨大的藥物消費增長潛力，為我國生物技術的發展提供了比國外更為廣闊的市場需求和發展潛力。生物制藥的應用主要在這幾個領域：各種腫瘤、自身免疫性疾病(如紅斑狼瘡、哮喘、多發性硬化癥、風濕性關節炎等)、糖尿病、心血管疾病等多發病、常見病的診斷和治療。近年來，生物制藥全球生物技術藥物增長率為15％～33％，遠高于年增長率為7％～10％的傳統制藥業，其總銷售額占藥物市場總額的比例從2000年的9％上升至2014年的23％。生物技術藥物2014年銷售總額估計可達1690億美元，其中單抗藥物至少占一半。

生物制藥研究與開發的主要環節包括：基因的克隆和基因工程菌的構造；重組細胞獲得和篩選；目的產物的分離純化等技術環節。目前已有多種表達系統用于生產具有醫療價值的人或動物來源的蛋白質藥物，主要的表達系統有原核表達系統(大腸桿菌，E.coli)、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞系統。其中哺乳動物細胞表達系統因哺乳動物細胞內有蛋白折疊形成正確立體空間構象所需要的分子伴侶，表達的糖基化蛋白藥物在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近于天然蛋白分子，因而越來越受到重視。哺乳動物細胞表達體系主要由宿主細胞和表達載體兩部分組成。表達細胞以中國卵巢癌細胞(CHO)表達體系最具代表性。蛋白在哺乳動物細胞表達的過程是重組表達載體與宿主細胞之間相互作用的一個復雜過程，包括5個相對獨立的環節：重組表達載體在宿主細胞染色體上的定位，主要指整合位點和基因拷貝數；蛋白mRNA的轉錄，包括轉錄效率和穩定性；蛋白藥物基因的翻譯；蛋白藥物的翻譯后加工、組裝；蛋白藥物的分泌等。

表達載體系統是獲得高效表達細胞株的關鍵，在確定宿主細胞后，蛋白藥物的表達量很大程度上由其表達載體的各表達調控元件及組成方式決定。一般來講，表達載體包括以下幾種基本元件：骨架序列、選擇性標志基因、表達盒以及一些調控序列。根據基因拷貝數是否擴增，表達載體可分為2類：可擴增和不可擴增表達的載體系統。可擴增載體系統具有特殊的選擇標志基因在外加的選擇壓力下實現宿主細胞染色體上的基因拷貝數的擴增，并可以連帶兩側的序列一同擴增，從而提高目的蛋白基因在宿主細胞染色體上的基因拷貝數。不可擴增的表達載體系統則在選擇壓力下不具備基因拷貝數的擴增。雖然目的基因低拷貝的載體也能達到較高水平的蛋白表達量，但若使用可擴增表達載體可轉錄出更多的目的蛋白的mRNA，更易獲得目的蛋白的高效表達。實現蛋白藥物產業化絕大多數采用可擴增表達載體。