[發(fā)明專利]一種關于抗體的蛋白質(zhì)含量的檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410440707.4
• 申請日: 2014-09-02
• 公開（公告）號: CN104155387A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設計）人: 劉玉應;丁兆;張仁懷;胡勛;雷富彬
• 申請（專利權）人: 四川匯宇制藥有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發(fā)明涉及一種檢測方法，特別涉及一種抗體的蛋白質(zhì)含量的檢測方法。

背景技術

蛋白質(zhì)含量測定是在生命科學研究中經(jīng)常使用的技術。目前，蛋白質(zhì)測定方法有多種，但是各有局限。常規(guī)抗體的蛋白質(zhì)含量的檢測方法采用UV280，即利用紫外分光光度計，檢測抗體在波長280nm處的OD值，然后根據(jù)抗體的摩爾消光系數(shù)計算出抗體的蛋白質(zhì)含量。該方法只能對純化后的抗體進行檢測，對于細胞培養(yǎng)液的蛋白質(zhì)含量不能進行檢測，因為細胞培養(yǎng)液中添加物、色素、雜質(zhì)比較多，會干擾檢測，導致檢測結果不準確。

另外，常規(guī)的Lowry法用于蛋白質(zhì)的含量測定。利用蛋白質(zhì)在堿性溶液中可形成銅-蛋白質(zhì)復合物，在此復合物中加入酚試劑后，產(chǎn)生藍色化合物，該藍色化合物在波長650nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，根據(jù)供試品的吸光度，計算供試品的蛋白質(zhì)含量。該方法試劑配制相對復雜，抗體檢測結果與實際結果相差比較大，一般不采用Lowry法進行抗體蛋白質(zhì)含量測定。

抗體的蛋白質(zhì)含量也可以采用Elisa來檢測，該方法是建立在抗原與抗體免疫學反應的基礎上，因此具有特異性；同時，由于酶標記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結合物，它可以催化發(fā)生反應，產(chǎn)生放大作用，因此，該方法靈敏度很高，并且可以同時檢測多個樣品。但是該操作較復雜，需要多次洗板，重復性差，且檢測時間長，通常需要24小時左右。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中所存在的上述不足，提供一種抗體的蛋白質(zhì)含量的檢測方法，該方法操作簡單、重復性好，檢測時間短，準確度高、影響因素少，不僅能檢測純化后的抗體的蛋白質(zhì)含量，還能檢測細胞培養(yǎng)液中抗體的蛋白質(zhì)含量。并且可以選用不同的抗體標準品，得到標準曲線，檢測得出不同抗體樣品的蛋白質(zhì)含量，應用范圍廣。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

一種關于抗體的蛋白質(zhì)含量的檢測方法，包括以下步驟：

(1)配制一組不同濃度的抗體標準品，用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)測定所述抗體標準品的峰面積，由峰面積和濃度梯度得出標準曲線；

(2)用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)測定抗體樣品的峰面積，由所述的標準曲線計算出樣品的濃度，即得抗體的蛋白含量。

所述的用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)測定，其條件是采用Protein?A色譜柱，以流動相A和流動相B進行梯度洗脫，流速為0.5-1.0mL/min，柱溫20-30℃，檢測波長為280nm；

根據(jù)抗體蛋白質(zhì)的特點，采用Protein?A色譜柱進行測定，Protein?A色譜柱一般只結合抗體蛋白質(zhì)，其它蛋白質(zhì)流穿出來，專一性特別強。

所述的流動相A,為磷酸鹽和氯化鈉混合的水溶液，pH為7.0-7.5；

所述的流動相B,為檸檬酸和氯化鈉混合的水溶液，pH為3.4-3.8；

本發(fā)明選用磷酸鹽、氯化鈉、檸檬酸作為流動相，均為常規(guī)試劑，價格便宜，成本低，并且容易配制。

所述的以流動相A和流動相B進行梯度洗脫，首先用流動相A進行3-5min平洗，再用流動相B進行10-15min洗脫；最后用流動相A進行3-5min洗脫。

一般細胞培養(yǎng)液pH值在6.8-7.4，同時，抗體蛋白質(zhì)在中性環(huán)境下，抗體蛋白質(zhì)容易吸附。所以我們首先用流動相A進行洗脫，pH控制在7.0-7.5，洗脫時間只需要3-5min，抗體蛋白質(zhì)能很好吸附。然后再在偏酸性環(huán)境下，pH為3.4-3.8進行洗脫。因為抗體蛋白質(zhì)在偏酸性環(huán)境下容易洗脫，所以只需要10-15min。最后用流動相A平衡，把層析柱再平衡好，為下一個樣品做好準備。有利于提高檢測的準確性和精確性。

所述的磷酸鹽為二水磷酸二氫鈉或十二水磷酸氫二鈉中的一種或兩種。

所述磷酸鹽的濃度為10-50mM。

所述的檸檬酸的濃度為10-50mM。

所述的氯化鈉的濃度為0.05-0.3M。

優(yōu)選的，所述磷酸鹽的濃度為18-22mM。

優(yōu)選的，所述的檸檬酸的濃度為18-22mM。

優(yōu)選的，所述的氯化鈉的濃度為0.12-0.18M。

所述的Protein?A色譜柱，優(yōu)選為Mabselect?SuRe?1ml預裝柱。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果：