[發明專利]冷凍保存誘導多能干細胞的試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201410437903.6
• 申請日: 2014-08-29
• 公開（公告）號: CN105432597B
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 馬燕琳;黃元華;李崎;蔣偉民;張宇
• 申請（專利權）人: 馬燕琳
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

本發明公開了一種冷凍保存誘導多能干細胞的試劑盒和方法，其中該試劑盒包括：第一冷凍工作液，所述第一冷凍工作液含有第一誘導多能干細胞培養基、乙二醇以及二甲基亞砜；以及第二冷凍工作液，其中，所述第二冷凍工作液含有第二誘導多能干細胞培養基、乙二醇、DMSO和蔗糖，其中，在所述第一冷凍工作液中乙二醇的體積含量與所述二甲基亞砜的體積含量相同，在所述第二冷凍工作液中乙二醇的體積含量與所述二甲基亞砜的體積含量相同，并且在所述第二冷凍工作液中乙二醇的體積含量是在所述第一冷凍工作液中乙二醇的體積含量中的兩倍。利用該試劑盒凍存iPSC安全有效，解凍后iPSC復蘇率高，多次培養傳代能維持正常的核型，保持其特性。

技術領域

本發明涉及冷凍保存誘導多能干細胞的試劑盒及方法。

背景技術

2006年，Yamanaka等人應用重編程技術將小鼠成纖維細胞誘導為多能干細胞，也被稱為誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)。相對于胚胎干細胞，iPSC由體細胞直接進入多能干細胞的狀態，避免了倫理學爭議；另外，iPSC的發現使研究者能得到不同病人特定基因類型的多種細胞來源的干細胞，應用其進行臨床治療可減少免疫排斥反應。因此iPSC在毒理學、藥理學、組織工程學以及再生醫學等領域備受關注。但是iPSC廣泛應用于臨床還面臨許多問題，其中安全性是首要問題，即要求iPSC的建系、培養、誘導分化、冷凍等過程無異源性成分。在細胞冷凍保存領域，許多研究致力于探索iPSC的無異源性冷凍方案，建立安全有效標準化并適用于臨床的冷凍保存方案。

然而，目前的細胞尤其是誘導多能干細胞的冷凍保存方法仍有待改進。

發明內容

本發明是基于發明人的下列發現而完成的：

用于細胞冷凍保存的常用方法包括慢凍法和玻璃化兩種。慢凍法是一種較經典的冷凍方法，但因其低復蘇率和高分化率，應用于iPSC的冷凍有一定的局限性。玻璃化冷凍通過高張力的玻璃化液和較快的降溫速率使溶液中的水不能形成晶體，而形成玻璃體，冷凍復蘇率效率相對較高，用來作為冷凍保存iPSC的方法被越來越廣泛地接受。但是由于玻璃化冷凍iPSC過程中一般采用開放式麥管，其中細胞與液氮直接接觸，存在污染風險，不符合臨床應用要求。

即目前iPSC的冷凍保存還沒有非常高效安全的標準化冷凍方案。本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種具有安全高效的誘導多能干細胞冷凍保存方案。

進而，發明人應用HFF作為飼養層細胞，以商品化的化學成分明確的mTeSR^TM1、mTeSR^TM2或E8培養基為iPSC培養基，商品化的玻璃化封閉式冷凍裝置為冷凍載體，封閉式玻璃化法冷凍保存iPSC，通過對解凍后的iPSC生長與分化情況進行比較，尋找并最終建立了一種安全高效的人誘導多能干細胞的冷凍保存方案。

因而，根據本發明的一個方面，本發明提供了一種用于冷凍保存誘導多能干細胞的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒包括：第一冷凍工作液，所述第一冷凍工作液含有第一誘導多能干細胞培養基、乙二醇以及二甲基亞砜；以及第二冷凍工作液，其中，所述第二冷凍工作液含有第二誘導多能干細胞培養基、乙二醇、DMSO和蔗糖，其中，在所述第一冷凍工作液中乙二醇的體積含量與所述二甲基亞砜的體積含量相同，在所述第二冷凍工作液中乙二醇的體積含量與所述二甲基亞砜的體積含量相同，并且在所述第二冷凍工作液中乙二醇的體積含量是在所述第一冷凍工作液中乙二醇的體積含量中的兩倍。

發明人驚奇地發現，利用本發明的試劑盒凍存誘導多能干細胞，細胞不會與液氮直接接觸，污染風險小，安全有效，符合臨床應用要求，并且經凍存的誘導多能干細胞，分化率低，解凍后復蘇率高，多次培養傳代能維持正常的核型，保持其特性。