[發明專利]冷凍保存誘導多能干細胞的試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201410437903.6
• 申請日: 2014-08-29
• 公開（公告）號: CN105432597B
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 馬燕琳;黃元華;李崎;蔣偉民;張宇
• 申請（專利權）人: 馬燕琳
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

1.一種冷凍保存誘導多能干細胞的方法，其特征在于，

所述方法采用一種用于冷凍保存誘導多能干細胞的試劑盒進行，所述試劑盒包括：

第一冷凍工作液，所述第一冷凍工作液含有第一誘導多能干細胞培養基、乙二醇以及二甲基亞砜；以及

第二冷凍工作液，其中，所述第二冷凍工作液含有第二誘導多能干細胞培養基、乙二醇、DMSO和蔗糖，

其中，在所述第一冷凍工作液中乙二醇的體積含量與所述二甲基亞砜的體積含量相同，在所述第二冷凍工作液中乙二醇的體積含量與所述二甲基亞砜的體積含量相同，并且在所述第二冷凍工作液中乙二醇的體積含量是在所述第一冷凍工作液中乙二醇的體積含量中的兩倍，

進一步包括：

第一解凍液，所述第一解凍液含有第三誘導多能干細胞培養基和蔗糖；以及

第二解凍液，所述第二解凍液含有第四誘導多能干細胞培養基和蔗糖，

其中，

在所述第一解凍液中蔗糖的濃度是在所述第二解凍液中蔗糖的濃度的兩倍，

所述第一至第四誘導多能干細胞培養基分別獨立地為選自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培養基中的任意一種，

在所述第一冷凍工作液中，乙二醇的含量為10體積％，二甲基亞砜的含量為10體積％，剩余為所述第一誘導多能干細胞培養基；以及

在所述第二冷凍工作液中，乙二醇的含量為20體積％，二甲基亞砜的含量為20體積％，蔗糖的含量為0.3M，剩余為所述第二誘導多能干細胞培養基，

在所述第一解凍液中，蔗糖的含量為0.2M，其余為所述第三誘導多能干細胞培養基；以及

在所述第二解凍液中，蔗糖的含量為0.1M，其余為所述第四誘導多能干細胞培養基，

進一步包括：

封閉式玻璃化冷凍組件，

所述方法包括：

(1)將選自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培養基中的任意一種、第一冷凍液和第二冷凍液各0.5ml分別加入到四孔板的三個孔中；

(2)將所述四孔板在37攝氏度、5％二氧化碳的培養箱中靜置以便平衡至少1小時；

(3)將待保存的誘導多能干細胞加入到所述四孔板中含有選自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培養基中的任意一種的孔中，放置1分鐘；

(4)將所述待保存的誘導多能干細胞從所述含有選自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培養基中的任意一種的孔中轉移至所述四孔板中含有所述第一冷凍液的孔中放置1分鐘，同時利用第二冷凍液制作體積為20微升的液滴；

(5)將所述待保存的誘導多能干細胞從所述含有第一冷凍液的孔中轉移至所述四孔板中含有所述第二冷凍液的孔中放置25秒后，將所述待保存的誘導多能干細胞轉移至所述體積為20微升的液滴，以便得到含有誘導多能干細胞的液滴；

(6)將所述含有誘導多能干細胞的液滴裝載于封閉式冷凍環上，并將所述封閉式冷凍環接觸預先經過冷卻的金屬塊表面，在所述液滴凝固后裝入塑料套管中，封口后放置于液氮中進行保存。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述金屬塊被預先冷卻至-196攝氏度。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述金屬塊被液氮預先冷卻至-196攝氏度。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，進一步包括通過下列步驟復蘇所述誘導多能干細胞：

(1)將選自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培養基中的任意一種、第一解凍液和第二解凍液各0.5ml分別加入到四孔板的四個孔中，以便得到含有第一解凍液的第一孔，含有第二解凍液的第二孔，含有選自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培養基中的任意一種的第三孔，以及含有選自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培養基中的任意一種的第四孔；

(2)將所述四孔板在37攝氏度、5％二氧化碳的培養箱中靜置以便平衡至少1小時；

(3)將攜帶待復蘇的誘導多能干細胞的冷凍環浸入到所述第一孔中，放置1分鐘；

(4)將所述待復蘇的誘導多能干細胞從所述第一孔轉移至所述第二孔中，放置1分鐘；

(5)將所述待復蘇的誘導多能干細胞從所述第二孔轉移至所述第三孔中，放置5分鐘；以及

(6)將所述待復蘇的誘導多能干細胞從所述第三孔轉移至所述第四孔中，放置5分鐘；

(7)將所述待復蘇的誘導多能干細胞從所述第四孔中接種于培養皿中，在37攝氏度、5％二氧化碳的培養箱中培養過夜，以便復蘇所述誘導多能干細胞，

其中，所述培養皿預先進行下列處理：

在OC培養皿中加入0.1重量％的明膠溶液0.5毫升，并在37攝氏度下放置30分鐘，以便使明膠均勻包被所述培養皿的底部；

移除所述培養皿中的明膠溶液，并在所述培養皿中加入人包皮成纖維細胞細胞懸浮液，其中，所述人包皮成纖維細胞懸浮液的濃度為0.4×10⁵個細胞/毫升；

將所述培養皿置于37攝氏度、5％二氧化碳的培養箱中進行培養；

待人包皮成纖維細胞貼壁后，向所述培養皿中加入濃度為10μg/ml的絲裂霉素C溶液1ml，置于所述培養箱內3小時滅活處理人包皮成纖維細胞；以及

移除所述絲裂霉素C溶液，并用無鈣離子的PBS溶液1ml將所述培養皿洗滌兩次后，加入人包皮成纖維細胞培養基1ml，

其中在接種所述待復蘇的誘導多能干細胞之前，移除所述培養皿中的人包皮成纖維細胞培養基，加入1ml選自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培養基中的任意一種，在所述培養箱中平衡至少1小時后進行所述接種。