[發明專利]一種黃瓜游離小孢子的滅菌方法

有效

• 申請號: 201410437096.8
• 申請日: 2014-08-29
• 公開（公告）號: CN104304001B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 劉立功;張峰;王晶;于拴倉;趙泓;李軍
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京五洲洋和知識產權代理事務所(普通合伙)11387
• 代理人: 劉春成

技術領域

本發明屬于植物組織培養的滅菌方法領域，特別涉及一種黃瓜游離小孢子的滅菌方法，該方法的小孢子離心處理步驟使用的滅菌提取液中，含有植物組培抗菌劑，能夠對黃瓜小孢子進行徹底滅菌。

背景技術

黃瓜游離小孢子培養，是通過誘導小孢子出胚可以快速產生純合的育種新材料(純系)，縮短了育種年限，提高育種效率，還可用作遺傳轉化的優良受體材料。此技術在國際上尚未建立起完善且穩定的培養技術體系，很重要的原因之一就是很容易在操作過程中發生污染，尤其是夏秋季節，污染率可達到80-90％，甚至全軍覆沒，嚴重影響試驗的結果和工作效率，很多實驗室在此易污染季節都停止試驗工作。污染的原因主要是黃瓜的花蕾外面長有大量的絨毛，而且花瓣包裹不緊實，在外植體清洗和滅菌過程中很難做到徹底滅菌，且部分外植體發生內源性污染，所以很難控制污染的發生。

中國專利申請“黃瓜游離小孢子的培養方法”(申請號200810022098.5，公布號CN101317548A，公布日：2008年12月10日)中記載的黃瓜游離小孢子的培養方法的花蕾消毒步驟中，是先將花蕾在75％酒精溶液中浸泡消毒，再用0.1％的生汞消毒，再用無菌水沖洗；在小孢子離心步驟中，采用未加入任何滅菌劑的液體培養基離心。該培養方法由于消毒不夠徹底，所以會對小孢子的后續組織培養產生不利影響。

因此，在植物小孢子培養的科研和實踐中，均需要一種既能夠對小孢子進行徹底消毒，又不影響小孢子生長分化的滅菌方法。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種黃瓜游離小孢子的滅菌方法，該方法包括花蕾消毒步驟、小孢子釋放處理步驟、小孢子離心處理步驟，得到無菌的純化小孢子；所述小孢子離心處理步驟使用的滅菌提取液中，含有植物組培抗菌劑，可以對黃瓜小孢子進行徹底滅菌。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種黃瓜游離小孢子的滅菌方法，將黃瓜花蕾進行消毒處理步驟、小孢子釋放處理步驟、小孢子離心處理步驟，得到無菌的純化小孢子；所述小孢子離心處理步驟使用的滅菌提取液中含有抗菌劑。

進一步地，所述抗菌劑為植物組培抗菌劑。

進一步地，所述滅菌提取液中，抗菌劑的質量體積比為0.2-0.3％。

進一步地，所述滅菌提取液為：以基本提取液為基礎，添加質量體積比為0.2-0.3％的抗菌劑。

進一步地，所述基本提取液是以B5基本培養基為基礎，添加質量體積比為10-14％的蔗糖。

進一步地，所述花蕾消毒處理步驟為：將黃瓜花蕾依次用酒精溶液和次氯酸鈉溶液消毒，再用無菌水沖洗，得到消毒后的花蕾；所述小孢子釋放處理步驟為：將所述消毒后的花蕾加入基本提取液，再進行擠壓處理、過篩處理，得到小孢子濾液；所述小孢子離心處理步驟為：將所述小孢子濾液進行第一輪離心處理，保留沉淀，再加入所述滅菌提取液；再進行振蕩處理、第二輪離心處理，保留沉淀，得到所述無菌的純化小孢子。

進一步地，所述小孢子離心處理步驟中，所述振蕩處理的時間為20-40min，轉速為30-50rpm。

進一步地，所述小孢子離心處理步驟中，所述第一輪離心處理的轉速為500-1000rpm，時間為2-5min。

進一步地，所述小孢子離心處理步驟中，所述第二輪離心處理的轉速為500-1000rpm，時間為2-5min。

進一步地，所述滅菌方法適用的黃瓜品種為“中農26”、“津優35”、“北京403”、“粵秀1號”。

本發明相比現有技術具有以下有益效果：

1、常規的滅菌方法是在提取純化小孢子之前進行的，而本發明是在提取純化小孢子的過程中的滅菌提取液中加入抗菌劑進行滅菌的，抗菌劑和小孢子接觸充分，滅菌徹底。

2、常規抗菌劑多是加入到小孢子提純后的小孢子懸浮培養液中，小孢子和抗菌劑長期接觸很容易對小孢子的后期發育造成不良影響，而本發明在提取純化過程中加入抗菌劑，處理后離心棄上清，抗菌劑發揮作用后就將其去除掉了，不會對小孢子的后期培養造成不良影響。

3、本發明通過嚴格控制抗菌劑的濃度、處理時間和搖床的轉速，既能夠達到滅菌目的又不影響后期小孢子的正常膨大、細胞分裂和胚胎發育。

4、本發明在提取純化小孢子的過程中加入抗菌劑，滅菌效果好，抗菌劑用量大大減少，對環境友好。

附圖說明

圖1：對比例1的無菌的純化小孢子在后續培養中后續培養2-4天后，在AGM(EVOS?f1型號)倒置顯微鏡下的照片。