[發明專利]疏花水柏枝愈傷組織和懸浮細胞顆粒的培養方法

有效

• 申請號: 201410435123.8
• 申請日: 2014-08-30
• 公開（公告）號: CN104351046A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 劉士平;曾文;薛艷紅;孔玉珊;蔣維;秦王格格
• 申請（專利權）人: 三峽大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務所 42103
• 代理人: 姜榮華

技術領域

本發明涉及一種植物組織或細胞的培養方法，涉及以疏花水柏枝（Myricaria?laxiflora）莖段為植物器官起源的愈傷組織和優良懸浮細胞顆粒的規模化生產方法，屬于植物組織或細胞培養領域。?

背景技術

疏花水柏枝系檉柳科（Tamaricaceae）水柏枝屬（Myricaria）多年生灌木，限制性地分布于三峽庫區長江兩岸自然消落地帶中部和下部沙灘地，海拔高度約為80～155?m，是唯一因三峽工程被列為中國珍稀瀕危植物的植物物種。水柏枝屬植物主要具有疏風解表、祛風通絡的功能，主治麻疹不透，風濕痹痛，癬等，含有多種有效中藥化學成分如黃酮類化合物、槲皮苷、山柰酚、槲皮素、柯伊利素、沒食子酸、沒食子酸乙脂、谷甾醇、胡蘿卜苷^[13]。疏花水柏枝為唯一的低海拔種類，可用于治療燙傷，耐受洪水沖擊，耐沙土掩埋和耐干旱等極端氣候環境。?

疏花水柏枝為天然資源，由于其生存環境惡劣，一年中有3-6個月處于淹水脅迫中，而且其生長緩慢，周期性長，三峽工程修建喪失其全部原生生境而瀕臨滅絕。因此人們嘗試通過各種途徑來解決對疏花水柏枝的需求問題以及生態保護。疏花水柏枝組織培養可以克服野生資源短缺、自然繁殖率底和人工栽培繁瑣且成功率低的問題。懸浮細胞培養直接由無菌的植物組織得來，培養周期短，重復性好，能得到大量的疏花水柏枝次生代謝產物。?

目前，疏花水柏枝的研究主要集中在其生態環境，生理變化，扦插和種子繁殖方向，并不能解決水柏枝屬植物資源匱乏的現狀。尚未有學者報道疏花水柏枝愈傷組織誘導和懸浮細胞培養體系的建立。?

發明內容

本發明的目的是提供一種疏花水柏枝愈傷組織誘導和懸浮細胞顆粒的培養方法，通過對疏花水柏枝莖段培養獲得愈傷組織，進而獲得優良的懸浮細胞體系具有生長速度快，分散性好等優點。?

本發明所述的植物組織是以疏花水柏枝莖段為原料，經不同激素配比得到性狀穩定的愈傷組織和懸浮細胞。?

本發明的愈傷組織和懸浮細胞是通過以下技術方案來實現的，包括的步驟有：?

1.得到無菌的疏花水柏枝植物體器官，比較得到體系根，莖，葉中全能性最為突出的部位，以及最適應的培養條件；2.將無菌的莖段接種到愈傷組織誘導培養基中進行愈傷組織的誘導和繼代培養，得到以疏花水柏枝組織為原料的愈傷組織；3.將愈傷組織接種到相應的液體培養基中振蕩培養，得到以疏花水柏枝器官為起源的性狀穩定的懸浮細胞顆粒。

其中，步驟1中得到無菌的疏花水柏枝植物體器官，以及篩選合適的外植體和培養條件可以參照如下方法得到：?

（1）采集回來的當年生疏花水柏枝嫩枝條先用自來水沖洗2-3遍，然后用酒精泡過的脫脂棉擦洗兩遍，再用消毒過的鑷子取要用的嫩葉或者莖段置于干凈的培養皿中，在超凈工作臺上進行滅菌。滅菌方式為先用75%的乙醇浸泡，再用有效氯為3%的次氯酸鈉浸泡，最后用無菌水漂洗4-5次，隨后接種于MS培養基中。優選的殺菌時間為75%乙醇30s，3%的次氯酸鈉2min。

（2）將經滅菌處理后的帶腋芽的莖段，嫩芽，葉分別接種于附加植物生長劑的MS培養基中，每種外植體處理接種三個平板，每個平板上接種十個外植體，培養篩選出合適的外植體。優選的最合適外植體為當年生的嫩莖段。?

（3）將經滅菌處理后的帶腋芽的莖段分別接種于含PVP(500?mg/L)，沒食子酸（50?mg/L），Vc(10?mg/L)+半胱氨酸（100?mg/L）的抗氧化劑且附加了植物生長劑的MS培養基中，每組接種三個平板，每個平板上接種十個莖段，培養觀察被氧化的數量，篩選出效果最明顯的抗氧化劑。優選的抗氧化劑為500mg/L的PVP。?

（4）將經滅菌處理后的帶腋芽的莖段分別接種于MS，B5，N6培養基中，每個接種三個平板，每個平板上接種十個莖段，每七天記錄一次芽生長情況，篩選出適合的基本培養基。優選的培養基為MS培養基。?

本發明中以疏花水柏枝莖段為起源的愈傷組織和懸浮細胞的培養方法中，步驟2中所述的愈傷組織的優選過程如下方法得到：?

將經滅菌處理后的帶腋芽的莖段接種于MS培養基中振蕩培養，加入PVP?500?mg/l,蔗糖30g/L，瓊脂7.0g/L。設計具有濃度梯度的6-BA，和2，4-D，每個接種三個平板，每個平板上接種十個莖段，培養篩選出適合的激素濃度，振蕩裝置旋轉式搖床轉速為120r/min。不同激素配比優化設計如下：