[發明專利]用于測量細胞增殖的雙標記法

有效

• 申請號: 201410429769.5
• 申請日: 2009-05-14
• 公開（公告）號: CN104263816B
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: S·克拉克;J·布拉德福
• 申請（專利權）人: 生命技術公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6809
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 李程達

本發明提供了利用核酸的雙脈沖標記來測量細胞新生核酸合成的方法。使用核苷類似物進行的核酸的第一脈沖標記允許確定基線核酸合成速率。使用第二核苷類似物進行的核酸的脈沖標記允許測量核酸合成的任何變化。可將核酸合成測量為細胞增殖(DNA)或基因表達(RNA)。該方法在脈沖標記之間不需要潛在地引入假象的中間清洗步驟。此外，該方法通過在用競爭性核苷類似物進行處理的同時或在此之前用受試化合物處理細胞或生物體，可用于就對細胞增殖的作用篩選化合物。

本申請是申請號為200980117709.7、申請日為2009年5月14日、發明名稱為“用于測量細胞增殖的雙標記法”的中國發明專利申請的分案申請。

發明領域

本公開內容涉及用于雙脈沖標記核酸的方法。

相關領域的描述

通常通過向在其中培養細胞的培養基中或飼喂動物的飲用水中加入核酸糖類似物(核苷)，或通過將其注射入待標記的動物中來進行以測定生長速率為目的的脈沖標記細胞DNA。對DNA類似物的定時暴露(其具有將該DNA類似物摻入活躍地合成的DNA的潛能)被定義為脈沖。用于脈沖標記DNA的標準方法包括使用5-溴2'-脫氧尿苷(BrdU)或放射性標記的核苷類似物。

用于檢測BrdU標記的DNA或放射性標記的DNA的方法在本領域內是熟知的。例如，可用抗BrdU單克隆抗體，然后用熒光標記的二抗處理含有BrdU標記的DNA的細胞。然后可通過標準技術，包括板測定、熒光顯微術、成像、高內涵篩選或流式細胞術來顯現和定量熒光標記。

剖析復雜的細胞過程(包括細胞增殖)，需要跟蹤生物分子(當它們在它們的原住地(native habitat)中行使功能時)的能力。近年來，用于標記生物分子的可選工具已從化學生物領域顯現出來--生物正交化學報道分子(bioorthogonal chemical reporter)。已描述了生物正交反應部分用于檢測代謝物和翻譯后修飾的用途(使用疊氮化物部分作為生物正交化學報道分子)。在通過代謝或通過化學修飾導入靶生物分子后，可通過使用下列3個高選擇性反應之一而用探針標記疊氮化物：Staudinger連接、Cu(I)催化的疊氮化物-炔烴環加成作用或張力提高的(strain-promoted)[3+2]環加成作用。Agard等人J Am ChemSoc.2004Nov 24；126(46):15046-7。

生物正交化學報道分子之前已用于通過摻入核苷似類物而標記核酸。因此，可使用生物正交標記例如Staudinger連接、疊氮化物和炔烴的Cu(I)-催化的[3+2]環加成作用(“點擊化學”)或“無銅”點擊化學(其獨立地由Barry Sharpless和Carolyn Bertozzi描述)脈沖標記DNA。Sharpless等人Angew Chem Int Ed Engl.2002Mar 15；41(6):1053-7(通過引用完全合并入本文)；Meldal等人J.Org.Chem.2002，67，3057(通過引用完全合并入本文)；Agard等人J Am Chem Soc.2004Nov 24；126(46):15046-7(通過引用完全合并入本文)；美國專利7,122,703；美國申請案2003000516671。點擊化學和Staudinger連接適合于通過直接檢測核苷酸摻入來測量細胞增殖。參見Salic等人，Methods and Compositionsfor Labeling Nucleic Acids，美國申請案20070207476和20070099222(于2006年10月27日提交)(通過引用完全合并入本文)。