[發(fā)明專利]一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410424794.4
• 申請(qǐng)日: 2014-08-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104178452A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛志剛;范國(guó)平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 同濟(jì)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 葉敏華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基及其用途，尤其是涉及一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

老年性黃斑變性(Age-related?Macular?Degeneration，AMD)是一種在老年人群中多發(fā)的眼底疾病。AMD臨床表現(xiàn)為中心視力進(jìn)行性減退，從而引起閱讀和其他行為障礙。前期研究工作發(fā)現(xiàn)AMD的形成與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)對(duì)視細(xì)胞外節(jié)盤膜吞噬消化能力下降相關(guān)，未被完全消化的盤膜殘余小體潴留于基底部細(xì)胞原漿中，并向細(xì)胞外排出沉積于Bruch膜，形成玻璃膜疣。除了細(xì)胞替代治療，目前尚無(wú)逆轉(zhuǎn)這一退行性過(guò)程并恢復(fù)視力的有效方法。細(xì)胞替代治療就是通過(guò)外科手術(shù)剝離患者病變的RPE細(xì)胞，再將各種來(lái)源的RPE細(xì)胞以懸浮液或聚合物支架為載體移植到有RPE遺傳缺陷動(dòng)物的視網(wǎng)膜下腔，可以有效地延緩光感受器細(xì)胞的退行性病變并改善視覺(jué)功能。

RPE是位于脈胳膜和神經(jīng)視網(wǎng)膜之間的連續(xù)單層細(xì)胞。其功能主要是維持視網(wǎng)膜細(xì)胞的自我更新，這包括吞噬消化脫落的光感受器細(xì)胞的視細(xì)胞外節(jié)盤膜；促進(jìn)視循環(huán)中重要的介質(zhì)11-順視黃醛的再生；調(diào)節(jié)眼內(nèi)的免疫反應(yīng)；參與形成視網(wǎng)膜-血管屏障等。而RPE細(xì)胞的這一生理功能異常與AMD的發(fā)生密切相關(guān)。在細(xì)胞替代治療中，目前常用的RPE移植的供體來(lái)源主要是胎兒及成年人的RPE。雖然誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)不涉及破壞胚胎細(xì)胞等倫理學(xué)問(wèn)題，而且避免了免疫排斥反應(yīng)，但是iPSC可能的致瘤性限制了其在治療AMD中的應(yīng)用。

目前，用來(lái)移植RPE的胎兒及成年人的RPE數(shù)量極為有限，不能滿足患者的需求。同時(shí)，在以往的RPE培養(yǎng)條件下，不僅需要使用transwell等昂貴耗材，而RPE擴(kuò)增速度緩慢，不能快速形成具有極性和生物功能的RPE單細(xì)胞層。這些都嚴(yán)重束縛了RPE細(xì)胞替代治療的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，包括第一RPE細(xì)胞培養(yǎng)基和第二RPE細(xì)胞培養(yǎng)基；

所述的第一RPE細(xì)胞培養(yǎng)基包括以下組分，以500ml計(jì)，各組分的用量關(guān)系如下：

α修飾最小必需培養(yǎng)基：380-405ml；

N1補(bǔ)充物：5ml；

谷氨酰胺：5mL：

青霉素-鏈霉素；5mL；

非必需氨基酸：5mL：

牛磺酸：100-150mg；

氫化可的松：10-15μg；

三碘甲狀腺原氨酸：0.008-0.012μg；

熱滅活胎牛血清：75-100ml；

所述的第二RPE細(xì)胞培養(yǎng)基包括以下組分，以500ml計(jì)，各組分的用量關(guān)系如下：

α修飾最小必需培養(yǎng)基：430-455ml；

N1補(bǔ)充物：5ml；

谷氨酰胺：5mL；

青霉素-鏈霉素：5mL；

非必需氨基酸：5mL；

牛磺酸：75-100mg；

氫化可的松：5-10μg；

三碘甲狀腺原氨酸：0.003-0.008μg；

熱滅活胎牛血清：25-50ml。

所述的第一RPE細(xì)胞培養(yǎng)基或第二RPE細(xì)胞培養(yǎng)基的各組分在配制培養(yǎng)基前均通過(guò)0.22μM孔徑的過(guò)濾介質(zhì)過(guò)濾，通過(guò)0.22μM孔徑的過(guò)濾介質(zhì)過(guò)濾用來(lái)除去可能存在的污染細(xì)菌。上述第一RPE細(xì)胞培養(yǎng)基或第二RPE細(xì)胞培養(yǎng)基可在4℃下穩(wěn)定保存3個(gè)月。

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基用于胚胎視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞快速體外擴(kuò)增。具體包括以下步驟：

(1)提前1～6小時(shí)，用α修飾最小必需培養(yǎng)基包被培養(yǎng)瓶，其中α修飾最小必需培養(yǎng)基的層粘連蛋白濃度是5～20μg/mL；

(2)快速在36～38℃水浴槽內(nèi)解凍胚胎RPE細(xì)胞，取出凍存管；

(3)將凍存管中的胚胎RPE轉(zhuǎn)移到錐形試管中，并加入第一RPE細(xì)胞培養(yǎng)基，離心，離心的操作條件為常溫，轉(zhuǎn)速為300～500x?g，離心時(shí)間為3～5分鐘；

(4)將步驟(3)錐形試管中的上清吸走，然后再加入第一RPE細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；

(5)將步驟(1)中培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基吸走，同時(shí)加入步驟(4)重懸后的細(xì)胞，混勻；