[發(fā)明專利]一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410421835.4
• 申請日: 2014-08-25
• 公開（公告）號: CN104181297A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發(fā)明（設計）人: 王金良;沈志強;董艷凱;董炳梅;陳金龍;魏鳳
• 申請（專利權）人: 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 徐槐

技術領域

????本發(fā)明涉及動物疫病診斷技術領域，尤其涉及一種檢測羊的偽狂犬病毒抗體的間接ELISA試劑盒，以此對羊群的偽狂犬病毒抗體水平及疫病分布與流行情況進行監(jiān)測。

背景技術

偽狂犬病，亦稱奧耶茲基氏病，簡稱PRV，是由皰疹病毒科的甲型皰疹病毒引起的。該病毒可感染人類和無尾猿以外的所有哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其它器官，如呼吸道。該病可危害各階段的羊群，死亡率高達100%，臨床上以發(fā)熱、奇癢以及腦脊髓炎癥狀為特征。該病在世界范圍內(nèi)發(fā)生且廣泛流行，近年來隨著我國肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和羊頻繁流動，本病給養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

gD是?PRV的主要結構蛋白，它不僅誘導體液免疫，而且誘導細胞免疫，同時是病毒粒子表面的病毒感染細胞的主要分子，在病毒吸附和侵入宿主細胞過程中發(fā)揮重要作用，為病?毒復制的必需基因，是一種重要的中和抗原，也是保護性抗體的主要目標，能誘導較好的保護反應，抵抗PRV強毒株攻擊，因此gD被作為PRV特異性抗原研究的首選蛋白。

目前，一般采用病毒中和試驗、乳膠凝集或ELISA方法檢測偽狂犬病毒的抗體。國內(nèi)外已有許多商品化的檢測試劑盒可供使用，但檢測對象多針對最為普遍和易感的豬。本發(fā)明應用涉及針對羊建立的偽狂犬病毒抗體的ELISA檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決問題是建立一種檢測羊PRV抗體的ELISA試劑盒，用以代替病毒中和試驗等傳統(tǒng)的血清學方法，用以實現(xiàn)敏感性高、特異性強、穩(wěn)定性好的高通量大規(guī)模的羊體內(nèi)PRV抗體水平的監(jiān)測。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，包括以下組分：包被板、陽性對照、陰性對照、酶標結合物、樣品稀釋液、20×濃縮洗滌液、底物液、終止液、封口膠。

上述酶標結合物是由酶標抗體稀釋液稀釋2000倍的HRP標記的兔抗山羊IgG（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）每一試劑盒裝有1瓶體積為20ml的酶標結合物，4℃保存；。

上述酶標抗體稀釋液為NaCl?8g，KCl?0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O?2.9g，KH₂PO₄?0.2g，甘油?20ml，小牛血清?200ml，Casein?5g，蔗糖?2g，?Triton?X-100?10ml，硫柳汞?0.1g，加純水定容至1L。

上述樣品稀釋液包括NaCl?8g，KCl?0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O?2.9g，KH₂PO4?0.2g，吐溫-20?5ml，甘油?10ml，小牛血清?100ml，硫柳汞?0.1g，加純水定容至1L。

上述包被板由偽狂犬病毒的重組gD蛋白作為包被抗原，并由封閉液封閉，所述封閉液為NaCl?8g，KCl?0.2g，Na₂HPO4·12H₂O?2.9g，KH₂PO4?0.2g，小牛血清?100ml，蔗糖?50g，明膠?1g，Casein?2.5g，硫柳汞?0.1g，加純水定容至1L。

上述陰性對照：以樣品稀釋液將不含PRV抗體的陰性羊血清做40倍稀釋，每一試劑盒裝有1只體積為1ml的陰性對照，4℃保存；

上述陽性對照：以樣品稀釋液將含PRV抗體的陽性羊血清做100倍稀釋，每一試劑盒裝有1只體積為1ml的陽性對照，4℃保存。?

上述重組gD蛋白的表達和純化包括如下步驟：

1）根據(jù)GenBank公布的登錄號為AY196984的PRV?Fa株的gD基因序列，設計引物序列如下：

P1：5’-GGGGAATTCTACCCGTACAC-3’

P2：5’-GGGCTCGAGCCTCAGGCGGA-3’

2）通過PCR擴增PRV?Fa株gD基因，與pMD18-T克隆載體連接；

3）雙酶切重組質粒pMD18-T-gD，構建重組表達載體PET-32a-gD；

4）重組質粒PET-32a-gD轉化感受態(tài)細胞BL21(DE3)，誘導表達，然后純化設備，親和柱進行親和純化。