[發明專利]一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒

有效

• 申請號: 201410421835.4
• 申請日: 2014-08-25
• 公開（公告）號: CN104181297A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 王金良;沈志強;董艷凱;董炳梅;陳金龍;魏鳳
• 申請（專利權）人: 山東省濱州畜牧獸醫研究院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 徐槐

1.一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括以下組分：包被板、陽性對照、陰性對照、酶標結合物、樣品稀釋液、20×濃縮洗滌液、底物液、終止液、封口膠。

2.根據權利要求1所述的一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述酶標結合物是由酶標抗體稀釋液稀釋2000倍的HRP標記的兔抗山羊IgG。

3.根據權利要求2所述的一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述酶標抗體稀釋液為NaCl?8g，KCl?0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O?2.9g，KH₂PO₄?0.2g，甘油?20ml，小牛血清?200ml，Casein?5g，蔗糖?2g，?Triton?X-100?10ml，硫柳汞?0.1g，加純水定容至1L。

4.根據權利要求1所述的一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液包括NaCl?8g，KCl?0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O?2.9g，KH₂PO4?0.2g，吐溫-20?5ml，甘油?10ml，小牛血清?100ml，硫柳汞?0.1g，加純水定容至1L。

5.根據權利要求1所述的一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述包被板由偽狂犬病毒的重組gD蛋白作為包被抗原，并由封閉液封閉，所述封閉液為NaCl?8g，KCl?0.2g，Na₂HPO4·12H₂O?2.9g，KH₂PO4?0.2g，小牛血清?100ml，蔗糖?50g，明膠?1g，Casein?2.5g，硫柳汞?0.1g，加純水定容至1L。

6.根據權利要求5所述的一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述重組gD蛋白的表達和純化包括如下步驟：

1）根據GenBank公布的登錄號為AY196984的PRV?Fa株的gD基因序列，設計引物序列如下：

P1：5’-GGGGAATTCTACCCGTACAC-3’

P2：5’-GGGCTCGAGCCTCAGGCGGA-3’

2）通過PCR擴增PRV?Fa株gD基因，與pMD18-T克隆載體連接；

3）雙酶切重組質粒pMD18-T-gD，構建重組表達載體PET-32a-gD；

4）重組質粒PET-32a-gD轉化感受態細胞BL21(DE3)，誘導表達，然后純化設備，親和柱進行親和純化。

7.根據權利要求1所述的一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述20×濃縮洗滌液為NaCl?80g，KCl?2g，Na₂HPO₄·12H₂O?29g，KH₂PO₄?2g，吐溫-20?5ml，加純水定容至500ml。

8.根據權利要求1所述的一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述終止液為1M?H₂SO₄，所述底物液為可溶型單組分TMB底物液。

9.根據權利要求1所述的一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括自封袋和使用說明書。

10.根據權利要求1所述的一種檢測羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒的使用方法，其特征在于，主要使用方法如下：

（1）在A1和A2孔中分別加入100?μl陰性對照；在A3和A4孔中分別加入100?μl陽性對照；

（2）取100?μl經1：40稀釋好的待檢樣品液加入相應孔中，并做好記錄；37?℃孵育1h；

（3）將各孔的液體棄入廢液桶，每孔加250μl的洗滌液進行洗板，重復5次，每次30s；

（4）每孔加100μl酶標結合物；37?℃孵育1h；

（5）重復步驟（3）；

（6）每孔加100?μl底物液；

（7）37℃避光顯色孵育10min；

（8）每孔加100?μl的終止液；立刻于450nm波長處測定各孔的吸光度值，即OD450nm值；

（9）臨界值（C.O.）的計算??正常情況下，陽性對照孔OD450值≥0.4；陰性對照孔OD450值≤0.2；臨界值=0.17+陰性對照孔均值；陰性對照孔OD450值大于0.2時應舍棄，如所有陰性對照孔OD450值都大于0.2時須重復實驗；陰性對照孔低于0.05時以0.05計算；

（10）結果判定??檢測樣品OD450值≥臨界值，判定該檢測樣品為陽性；檢測樣品OD450值＜臨界值，判定該檢測樣品為陰性。