[發(fā)明專利]一種豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410420796.6
• 申請日: 2014-08-25
• 公開（公告）號: CN104250636A
• 公開（公告）日: 2014-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?jiān)S科;孫進(jìn)忠;王延輝;王瑩;田克恭
• 申請（專利權(quán)）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N1/20;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/35;C12R1/93
• 代理公司: 北京華夏正合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，以及豬肺炎支原體的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

1974年，德國學(xué)者Tischer等從連續(xù)傳代的豬腎細(xì)胞系PK15細(xì)胞中檢出一種細(xì)胞污染物，是一種不能引起細(xì)胞病變的病毒樣粒子。1982年，該學(xué)者進(jìn)一步研究證實(shí)：該病毒的基因組由單股環(huán)狀的DNA組成，因而將其命名為豬圓環(huán)病毒(Porcine?Circovirus，PCV)。

豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒，直徑平均為17?nm。根據(jù)豬圓環(huán)病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差異，PCV被劃為無致病性PCV1和致病性PCV2兩個(gè)基因型，其中PCV2主要引起豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(Pig?Multisystemic?Wasting?Syndrome，PMWS)，還會引起豬皮炎腎病綜合征(Porcine?Dermatitis?and?Nephropathy?Syndrome，PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine?Respiratory?Disease?Complex，PRDC)、增生性壞死性肺炎(Proliferative?and?Necrotizing?Pneumonia，PNP)、先天性震顫(Congenital?Tremors，CT)等疾病，總稱為豬圓環(huán)病毒病(Procine?Circovirus?Disease，PCVD)。在臨床上，PCV2主要侵害豬的肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，主要感染5-12周齡的仔豬，病豬的臨床癥狀為：漸進(jìn)性消瘦或生長遲緩、營養(yǎng)不良、咳嗽、呼吸困難、黃疸、腹瀉、皮膚蒼白、淋巴結(jié)腫大、腎臟灰白水腫等，可成為僵豬，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。

PCV2感染可引起豬的免疫抑制，從而使機(jī)體更易感染其他病原，這也是豬圓環(huán)病毒與豬的許多疾病混合感染有關(guān)的原因。最常見的混合感染有豬肺炎支原體(Mycoplasma?hyopneumoniae，Mhp)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒，呈二重感染或三重感染，導(dǎo)致病豬的病死率也將大大提高，有的可達(dá)25％-40％。

豬肺炎支原體會引發(fā)豬支原體肺炎(Mycoplasmal?pneumonia?of?swine,MPS)，該病又稱豬氣喘病(李彥明,張映.豬肺炎支原體生物學(xué)研究進(jìn)展,動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2003,24(3):25-27)或豬地方性流行性肺炎，是一種豬接觸性慢性呼吸道疾病，分布十分廣泛，以慢性、接觸性、高度傳染性、高發(fā)病率以及低死亡率等為特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為咳嗽和呼吸困難，解剖時(shí)以肺部病變?yōu)橹鳎纫詢煞涡娜~、中間葉和尖葉出現(xiàn)胰樣變和肉樣變?yōu)槠涮卣鳌Ｒ掳⑷A大學(xué)Ross研究發(fā)現(xiàn)：Mhp感染后淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力下降，細(xì)胞免疫力下降，肺泡巨噬細(xì)胞對病原的吞噬和清除能力亦下降，抑制性T細(xì)胞的活動增強(qiáng)，導(dǎo)致呼吸道免疫力減弱，抗病力下降，從而使其他病原體更容易侵入，可繼發(fā)感染豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)等，從而導(dǎo)致多種疫苗接種失敗。

PCV2的生物學(xué)特性比較特殊，雖然可以在體內(nèi)長期以高滴度存在，但在體外培養(yǎng)中其增殖滴度反而較低且不穩(wěn)定，在國際上應(yīng)用PK15傳代細(xì)胞培養(yǎng)PCV2的最高含量很難超過10^3.5TCID₅₀/ml；而且免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示受PCV2感染的PK15細(xì)胞比例僅有20％-30％，因而PCV2產(chǎn)毒滴度較低，這與當(dāng)前大規(guī)模動物疫苗生產(chǎn)不相適應(yīng)(沈璐.豬圓環(huán)病毒2型熒光定量PCR檢測方法的建立及培養(yǎng)工藝的初步探討.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文)。

豬肺炎支原體的培養(yǎng)難度較大，影響了其在遺傳、生化、免疫等方面的研究(邵國青.豬肺炎支原體分子生物學(xué)研究進(jìn)展.中國人獸共患病雜志，1999，15(2)：68-73)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明人在試驗(yàn)過程中意外地發(fā)現(xiàn)，豬圓環(huán)病毒和豬肺炎支原體共同培養(yǎng)時(shí)，豬圓環(huán)病毒的滴度有較大幅度的提高。通過這種培養(yǎng)方法，可以獲得高滴度的豬圓環(huán)病毒，并且利用此培養(yǎng)方法制備出的豬圓環(huán)病毒還可應(yīng)用于制備豬圓環(huán)病毒和豬肺炎支原體的疫苗組合物。

由此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括：(1)培養(yǎng)動物細(xì)胞，(2)將豬圓環(huán)病毒、豬肺炎支原體分別接種于動物細(xì)胞上，以同時(shí)培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒和豬肺炎支原體。

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)方法中動物細(xì)胞為豬腎傳代細(xì)胞系、非洲綠猴腎細(xì)胞系、猴胚胎腎上皮細(xì)胞系和豬睪丸細(xì)胞系中任一細(xì)胞系中的細(xì)胞。