[發明專利]用于檢測肝癌與肝硬化相關多肽-蛋白組合式標志物的雙抗體夾心試劑盒

有效

• 申請號: 201410419575.7
• 申請日: 2014-08-22
• 公開（公告）號: CN104316695A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 魏開華;鄭俊杰;侯利平;孫云波;宋純艷;楊保安;周婷婷;甄蓓;劉曙晨
• 申請（專利權）人: 北京蛋白質組研究中心;中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及用于檢測肝癌與肝硬化相關“多肽-蛋白組合式標志物“的雙抗體夾心酶聯免疫吸附法或化學發光法試劑盒。?

背景技術

我國是肝癌發生率高的國家，發病率占全球55％，且呈年輕化的趨勢；全國每年由此導致各種肝病的死亡人數超過30多萬，死亡率占全球45％。肝癌已成為死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤。多種損肝因素引起的肝臟損害和炎癥是肝纖維化、肝硬化的病理學基礎，“肝炎-肝纖維化-肝硬化-肝癌”的途徑是肝癌發展的必經過程。盡管對于肝硬化轉為肝癌幾率的報道不盡相同，多數研究仍將肝硬化作為肝癌發生的最大風險因素。80％左右的肝癌患者伴隨有肝硬化或晚期肝纖維化。因此要做到肝癌和肝硬化的早期發現、早期診斷、早期治療，在肝硬化階段即進行介入預防，將有效降低肝硬化轉向肝癌的發生率及死亡率。?

對于肝癌和肝硬化的診斷方法主要包括病理學、影像學和血清學診斷3種。其中，肝組織活檢是診斷肝癌和肝硬化最為常用的檢驗金標準，但作為一種侵入性檢查，其并發癥的發生率為1％～5％，死亡率為1/10000～1/1000。肝穿刺盲目性大、取材不夠、肝臟病變的不均一，均會導致取樣誤差，不能反復取材進行動態觀察。患者心理承受能力也限制該微創檢查。常用的無創性診斷方法有影像學診斷及血清學診斷，其中，影像學診斷主要是B超和CT，這些方法在檢測伴有門靜脈高壓的晚期肝纖維化時，具有較高的靈敏度和特異性，但用于診斷早期肝癌和肝硬化的敏感性卻不強，因此，通過檢測血清標志物，觀察并輔助判斷肝癌和肝硬化，將具有很重要的臨床意義。臨床常用的肝癌和肝硬化血清標志物包括甲胎蛋白(AFP)和膽堿酯酶(CHE)，但各有其局限性，主要表現為靈敏度仍然偏低。?

相關研究表明，腫瘤在癌變過程中，細胞蛋白質和酶的增殖不但使血清蛋白變化，也影響到血清多肽。2006年Villanueva?J的研究發現了61種具有癌癥特征的肽段標志物和不同蛋白酶活性之間存在著直接關聯，認為血清多肽?組蘊含蛋白降解模式，攜帶具有重要臨床價值的標志物信息，血清多肽比蛋白能更精細地區分某些腫瘤差異，血清多肽可能會識別其他標志物無法識別的腫瘤，并且指出幾種肽段模式在臨床上有望作為腫瘤的標志物，對前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌的診斷有一定研究意義。2002年以來，血清多肽已成功應用于多種腫瘤的診斷研究，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、淋巴癌、腦膠質細胞瘤等。Petricoin等利用生物信息學手段對血清多肽圖的組成等模式進行分析，成功地對早期卵巢癌進行了診斷，敏感性、特異性和陽性預測值分別為100％，95％和94％，顯著優于傳統的CAl25檢測，特別是對早期卵巢癌(I期)的診斷也十分成功。?

血清多肽與蛋白標志物在ELISA檢測方法上仍存在諸多不足，尤其是多肽與蛋白標志物的聯合檢測尚處于簡單的“混合型”模式。ELISA檢測方法中，最常使用雙抗體夾心ELISA，該方法在血清多肽和蛋白進行聯合檢測的研究中，一般將幾種相關的，甚至無關聯的蛋白或多肽標志物分別檢測，可靠性大打折扣。Sogawa報道了采用肝纖維化多肽標志物FIC5.9的N端和C端來制備不同抗原表位的特異性多肽抗體，并形成了多肽標志物的雙抗體夾心ELISA檢測方法，具備一定的創新思維，但對于多數已經報道的潛在腫瘤多肽標志物來講，一般分子量較小，尤其對于2kDa以下的小分子多肽，存在肽鏈短小、免疫原性弱等局限，難以通過抗N端表位、C端表位或中間表位的辦法來建立雙抗體夾心檢測。?

激肽釋放酶—激肽系統(Kallikrein—Kinin?system，KKS)對于細胞增殖、凋亡及腫瘤的發生和血管的生成有著重要作用。KKS是一種內源性的多蛋白體系，高分子量激肽原(HK)是其代謝通路中的一個典型蛋白，它以糖蛋白形式存在于血漿中，分子量120kDa，該分子可劃分為6個結構域(D1-D6)。D1、D2和D3區組成重鏈；D3后是1個小區段D4，含有緩激肽片段；D5和D6區組成分子的輕鏈。HK在Lys362-Lys363和Arg371-Ser372之間被激活后，釋放D4區緩激肽BK，產生HKa。HKa由含D1、D2和D3的重鏈和含D5和D6的輕鏈組成，重鏈和輕鏈由1個二硫鍵連接起來。HK轉變為HKa后，發生結構重排、構象變化等使D5區暴露更加明顯，從而發揮更好的生物學作用。Alvin?H.Schmaier等認為HKa可以通過與內皮細胞結合抑制新血管的生成來阻止腫?瘤的形成，同時HKa還可以通過阻斷EGFR與uPAR的結合來抑制腫瘤的轉移和侵襲。?