[發明專利]提高多殺菌素產量的發酵方法

在審

• 申請號: 201410418363.7
• 申請日: 2014-08-22
• 公開（公告）號: CN105441518A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發明（設計）人: 王書睿;周賢龍;劉靜
• 申請（專利權）人: 牡丹江佰佳信生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/62
• 分類號: C12P19/62;C12R1/645
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及微生物發酵領域，具體地說，涉及一種提高多殺菌素產量的發酵方法。

背景技術

多殺菌素，是刺糖多孢菌有氧發酵產生的次級代謝產物，屬于大環內酯類化合物，其商業化產品中有效的活性組分為多殺菌素A(85％-90％)和多殺菌素D(10％-15％)。多殺菌素沒有抑菌活性，卻有很好的殺蟲活性，對鱗翅目和纓翅目害蟲有較廣的殺蟲譜，對雙翅目、鞘翅目和膜翅目中某些大量吞食葉片的害蟲種類有很好的防治作用，在防治鱗翅目害蟲上，多殺菌素是現有殺蟲劑中選擇性最高的化合物之一，其活性與氯氰菊酯相當。多殺菌素具有高殺蟲活性的同時，對非靶標生物則表現出低毒，它對哺乳動物、鳥類和有益昆蟲毒性較低，對水生動物只有輕微的毒性，而且對哺乳動物無致癌、致畸、致突變或神經毒性的作用。多殺菌素在環境中通過多種組合途徑降解，主要為光降解和微生物降解，降解產物為對環境無害的碳、氫、氧、氮等自然組分，且降解周期短，在土壤中多殺菌素光降解的半衰期為9-10天，在水中多殺菌素光降解的半衰期則小于1天，在葉面上多殺菌素光降解的半衰期是1.6-16天。與一般殺蟲劑相比，多殺菌素具有見效快、無副作用、選擇性高、對天敵安全、半衰期短、易降解、不易產生藥物抗性等優點，是理想的高效低毒綠色農藥，是治理抗性害蟲的首選替代農藥新品種。

目前在我國，多殺菌素還未實現工業化生產，主要原因是發酵產量偏低，不能滿足工業化要求。在微生物發酵過程中，代謝產物的大量積累一般會抑制菌體的生長和目標產物的繼續合成，這種現象叫做代謝產物阻遏，在多殺菌素生產的過程中，如果能降低產物濃度，削弱這種產物抑制作用，將成為提高多殺菌素產量的一個突破要點。

發明內容

本發明的目的是提供一種提高多殺菌素產量的發酵方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種提高多殺菌素產量的發酵方法，其是向刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)的發酵培養基中添加大孔樹脂，并在發酵過程中補加全脂奶粉，從而提高多殺菌素的產量。

本發明中涉及的刺糖多胞菌為刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa)Z68，該菌已在ZL201110224366.3中公開。

前述的方法，所述發酵培養基中含有如下組分：大豆粉5-30g/L、玉米淀粉20-40g/L、葡萄糖30-50g/L、玉米漿15-20g/L、碳酸鈣4-6g/L和大孔樹脂5-15g/L(優選10g/L)，以水配制。所述大豆粉是將粉碎后的大豆過20-400目篩后應用于培養基。

優選地，所述發酵培養基中還包括棉籽餅粉10-20g/L和/或酵母浸粉1-5g/L和/或豆油4-6g/L。

本發明中使用的大孔樹脂型號為D1300，比表面積550-600m²/g，平均孔徑6nm。

前述的方法，發酵的條件為：培養溫度26-30℃，轉速150-220rpm，通氣比1:0.3-0.7，罐壓0.03-0.04MPa，溶氧控制在40％以上，發酵周期為168-216hr。

優選地，發酵的條件為：培養溫度28℃，轉速200rpm，通氣比1:0.5，罐壓0.03MPa，溶氧控制在40％以上，發酵周期為192hr。

前述的方法，發酵開始后第120hr內，第一次補加全脂奶粉至終濃度5-20g/L，優選15g/L。

前述的方法，發酵開始后第120-192hr內，第二次補加全脂奶粉至終濃度5-20g/L，優選5g/L。

優選地，發酵開始后第96hr，第一次補加全脂奶粉至終濃度15g/L，發酵開始后第144hr，第二次補加全脂奶粉至終濃度5g/L。

多殺菌素的發酵產量為發酵液中多殺菌素產量與收集的大孔樹脂洗脫下的多殺菌素的產量之和。

發酵液中多殺菌素含量分析：

1)取發酵液1ml，加入9ml甲醇溶液，搖勻；

2)超聲波震蕩20min，靜止10min，使固液分層；

3)取上層有機相，以0.45μm有機濾膜進行過濾；

4)過濾后有機相作為供試液通過高效液相色譜儀進行效價檢測；

5)高效液相色譜條件：150×4.6mm(id)，5μm，不銹鋼C18反相色譜柱；柱溫35℃，流速1.0mL/min，以甲醇∶乙腈∶水(體積比為9∶10∶1)為流動相進行分離，進樣量20μl，利用紫外檢測器在246nm波長下進行檢測。

大孔樹脂洗脫液中多殺菌素含量分析：