[發明專利]一種用于系統性紅斑狼瘡的基因診斷試劑盒

在審

• 申請號: 201410417499.6
• 申請日: 2014-08-21
• 公開（公告）號: CN105420347A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發明（設計）人: 馮學兵;孫凌云
• 申請（專利權）人: 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京中新達專利代理有限公司 32226
• 代理人: 孫鷗;朱杰

技術領域

本發明涉及一種自身免疫病的基因診斷試劑盒，更具體的說是一種用于系統性紅斑狼瘡的基因診斷試劑盒，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

自身免疫性病是一類被忽略的，常見的致死致殘的慢性疾病。系統性紅斑狼瘡(systemicIupuserythematosus，SLE)被認為是自身免疫病的原型疾病，可累及身體任何器官。SLE的診斷目前主要依據美國風濕病學會1982年制定以及1997年修訂的分類標準，2009年系統性紅斑狼瘡國際協作組(SLICC)又對其進行了更新。但這些SLE分類標準均以從自身免疫性疾病病譜中將SLE分離出為主要目的，不利于鑒別或發現輕型SLE和早期SLE。而對于SLE來說，延誤治療是導致死亡的獨立危險因素，提示早期診斷對患者預后至關重要。

當前已有很多嘗試應用生物標記來幫助診斷SLE的研究，但由于疾病的高度異質性，多數均告失敗。近十年來，隨著分子生物學的進展，人們發現I型干擾素在SLE患者中水平增高，該通路基因多態性位點也與疾病相關，并且在人類和動物中I型干擾素治療可誘導產生狼瘡樣表現，說明干擾素誘導基因在疾病發生中起重要作用。在本發明作出之前，已有嘗試將干擾素誘導基因應用于臨床，不過幾乎所有的研究均致力于進行SLE疾病活動性判斷，包括早期研究也顯示干擾素誘導基因表達水平確實與疾病活動評分及一些特定臨床表現相關。但是，之后的長期隨訪觀察顯示，干擾素誘導基因表達水平并不隨疾病活動性變化而改變，提示SLE體內I型干擾素的異常可能是疾病所固有的，從而對診斷更有幫助。

I型干擾素誘導基因已報道與SLE相關的至少有幾十個，其中一些也與其他自身免疫病(如類風濕關節炎、干燥綜合征、炎性疾病等)有關，缺乏特異性。我們前期先從14個主要基因中通過因子分析篩出5個最具代表性的基因，再與正常人及其他免疫病患者對比，分析其在SLE診斷中的價值。其后嘗試檢測5個干擾素誘導基因表達，發現對系統性紅斑狼瘡有一定診斷價值，但一方面檢測基因數多，費時費力且增加消耗；另一方面經過受試者工作特征曲線分析，其中兩個并不對診斷起較大作用。

發明內容

本發明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種用于系統性紅斑狼瘡的基因診斷試劑盒。

本發明的技術方案是：

一種系統性紅斑狼瘡的基因診斷試劑盒，其主要技術特征在于，包括有用于擴增OASL、IGS15和LY6E這3個基因的引物，還包括看家基因RPLPO的引物，以及擴增試劑。

所述各基因引物序列分別為：

OASL-F：5’-CCATCACGGTCACCATTGTG-3’

OASL-R：5’-ACCGCAGGCCTTGATCAG-3’

ISG15-F：5’-GGTGGACAAATGCGACGAA-3’

ISG15-R：5’-CAGCCCGCTCACTTGCT-3’

LY6E-F：5’-ACTGCGTGACTGTGTCTGCTA-3’

LY6E-R：5’-AGGCTGTGGCCAAATGTC-3’

RPLPO-F：5’-GTTTCATTGTGGGAGCAGACA-3’

RPLPO-R：5’-CATGGTGTTCTTGCCCATCA-3’

所述擴增試劑包括預混有PCR緩沖液和dNTPs的熱啟動Taq酶、ROX惰性參比染料和超純水。

所述擴增試劑由以下體積的組分組成：cDNA1.0μl，PremixExTaqTM(2×)10μl，ROX惰性參比染料(50×)0.4μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，超純水7.8μl。

所述通過實時定量PCR技術檢測LY6E、IGS15、OASL的表達，取3次檢測值的平均數計算熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數，減去看家基因RPLPO到達閾值時的循環數值計算出差異值，再通過2^-差異值計算各基因相對表達值。

所述通過計算改良干擾素指數進行結果判斷，以待測樣品基因相對表達值-正常組平均基因相對表達值，再除以正常組基因表達標準差，計算出單個基因干擾素指數，將對應于LY6E、ISG15和OASL的三個值相加，即為改良干擾素指數。

所述在改良干擾素指數為2.37時，其診斷的敏感性和特異性達到最佳界值，分別為70％和80％。