[發明專利]微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法

有效

• 申請號: 201410414923.1
• 申請日: 2014-08-21
• 公開（公告）號: CN104232722B
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 宋浩雷;張敏然;張耀勛;周利坤
• 申請（專利權）人: 宋浩雷
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12N15/74;C12N1/21;C12R1/34
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 鄭自群

1.一種微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法，其特征在于：利用重組恥垢分枝桿菌發酵轉化植物甾醇生產9α-羥基雄烯二酮，包括如下步驟：

第一步，重組表達載體pMV261-ksh的構建；

首先，通過PCR技術獲得來源于恥垢分枝桿菌mc²155且帶有酶切位點的ksh基因；所述酶切位點分別為EcoRI和HindIII；所述ksh基因為3-甾酮-9α-羥基化酶基因；

其次，將其與克隆載體pMD-18T連接，以獲得該基因的大量克隆；

再次，進行雙酶切、片段純化，之后與恥垢分支桿菌表達載體pMV261連接；

最后，將得到的連接體系轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，得到重組質粒；

第二步，重組菌株的構建；

第三步，菌種繁殖及發酵轉化。

2.根據權利要求1所述的微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法，其特征在于：第二步中，先制備恥垢分枝桿菌感受態細胞，再將第一步獲得的重組質粒電轉入到恥垢分枝桿菌感受態細胞中。

3.根據權利要求1所述的微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法，其特征在于：所述恥垢分枝桿菌感受態細胞的制作方法：

將濃度10⁷-10⁹個/ml的恥垢分枝桿菌以10％的接種量接種于LB液體培養基中，LB液體培養基中含有重量百分比0.05％的吐溫80，在30℃下培養至OD₆₀₀＝0.4-0.5時，添加終濃度為1％的甘氨酸繼續培養，當OD₆₀₀達到0.8-1.0時開始制備感受態；

首先，將菌懸液以11000g、4℃離心20min后，棄去上層清液；接著，以培養基體積1/6量添加含有重量百分比0.05％吐溫80的甘油吐溫溶液重懸菌體，甘油溶液的質量百分比為10％，4000g、4℃離心10min，離心完畢后棄去上層清液；以上述方法再次洗菌2次，使用的甘油吐溫溶液體積分別為培養基體積的1/15及1/30；最后，以2mL、重量百分比10％的甘油重懸菌體，分裝于50μl/1.5mL EP管內-70℃保藏備用。

4.根據權利要求1所述的微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法，其特征在于：第三步中，先在種子培養基中進行菌種繁殖，待種子培養基OD₆₀₀為15-20時，以20-50％的接種量將其接入裝有發酵培養基和植物甾醇的發酵罐中進行發酵轉化。

5.根據權利要求4所述的微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法，其特征在于：第三步中發酵轉化的條件為：溫度25-32℃、發酵初始PH 6.0-8.0、溶氧量20-40％、培養轉速150-200rpm、培養周期80-120h。

6.根據權利要求4所述的微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法，其特征在于：所述種子培養基的組分為：葡萄糖8-15g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3-0.8g/L、(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O0.02-0.06g/L、CaCO₃ 4.5-5.5g/L和檸檬酸1.0-3.0g/L，所述種子培養基的PH為6.0-8.0。

7.根據權利要求4所述的微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法，其特征在于：所述發酵培養基的組分為：葡萄糖15-30g/L，蛋白胨15-30g/L，豆餅粉10-25g/L，MgSO₄·7H₂O0.5-1.0g/L，(NH₄)₂Fe(SO₄)2·6H₂O 0.02-0.06g/L，CaCO₃ 4.5-5.5g/L，檸檬酸1.0-3.0g/L和NH₄NO₃ 0.5-1.5g/L，所述發酵培養基的PH為6.0-8.0。

8.根據權利要求4所述的微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法，其特征在于：植物甾醇與發酵培養基的重量百分比為1.5-3.0％。