[發明專利]微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法

有效

• 申請號: 201410414923.1
• 申請日: 2014-08-21
• 公開（公告）號: CN104232722B
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 宋浩雷;張敏然;張耀勛;周利坤
• 申請（專利權）人: 宋浩雷
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12N15/74;C12N1/21;C12R1/34
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 鄭自群

本發明提出了一種微生物發酵生產9α?羥基雄烯二酮的方法，利用重組恥垢分枝桿菌發酵轉化植物甾醇生產9α?羥基雄烯二酮，包括如下步驟：重組表達載體pMV261?ksh的構建；重組菌株的構建；菌種繁殖及發酵轉化。本發明通過基因工程手段獲得3?甾酮?9α?羥基化酶基因(ksh)過表達的基因工程菌株，該菌株經過120h發酵可以使植物甾醇的轉化率高達95％以上，具有產率高、副產物少、發酵時間短，且提取簡單、污染小、環保壓力小等特點，極具工業生產的優勢。

技術領域

本發明涉及甾體類藥物中間體的生產方法，特別是微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法。

背景技術

9α-羥基雄烯二酮(9α-hydroxy androstenedione)簡稱9α-OH AD(結構式如下所示)，最早是由諾卡氏菌發酵液中分離得到的一種甾體物質。9α-OH AD可用于合成皮質激素、抗雄性激素、抗雌性激素及避孕功能藥物，是一種非常重要的甾體激素中間體。

目前用于微生物發酵生產9α-OH AD的底物主要有兩種方法：第一種方法是采用諾卡氏菌(Nocardia)、紅球菌(Rhodococcus)、棒桿菌(Corynebacterium)及Cylindrocarponradicicola對底物雄烯二酮(AD)進行9α-羥基化，生成9α-羥基雄烯二酮(9α-OH AD)。如專利“利用微生物轉化制備9α-羥基-雄烯二酮的方法”(公開號CN 103361394A，申請號201310342583.1)公開了一種利用紅平紅球菌發酵轉化4-雄烯二酮生產9α-OH AD的方法，但是該法存在轉化率低、產物濃度低、生產成本高等缺陷，使得其不具備工業化生產的優勢；另一種方法是利用分枝桿菌或偶發分支桿菌對單一或多種植物甾醇底物進行側鏈降解以及9α-羥基化等一系列生化反應生成9α-OH AD。如專利“一種制備9a-羥基雄烯二酮的方法”(公開號CN 103343155A，申請號201310259697.X)提出了一種利用偶發分枝桿菌ATCC35855為生產菌種，以植物甾醇為底物生產9α-OH AD 的方法，植物甾醇的轉化率為60％左右，專利“發酵生產9-OH-AD的恥垢分枝桿菌、菌劑、制備方法和應用”(申請號201310628652.5，公開號CN 103667126A)中誘變得到一株的恥垢分枝桿菌(保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M2013544)，此菌株有效抑制了9α-OH AD的1,2位脫氫，最終9α-OH AD質量收率可達到50-55％。

無論是從發酵工藝對環境的污染，還是從產物收率和純度來講，目前已經公開的方法都不適合工業化生產9α-OH AD。

3-甾酮-9α-羥基化酶(KSH)是微生物甾體代謝降解途徑中的關鍵酶，其具有兩項重要作用：一是KSH能在甾體母核9α為導入羥基；二是作為甾醇微生物降解側鏈制備雄甾酮類化合物的關鍵酶，KSH與3-甾酮-△¹-脫氫酶共同作用使母核開環，最終降解為水和二氧化碳。通過為該基因進行改造可獲得生產4-雄烯二酮、1,4-雄烯二酮或9α-羥雄烯二酮等重要甾體藥物中間體的基因工程菌。范書玥，魏巍等將分枝桿菌Mycobacterium sp.NwIB-01中的3-甾酮-9α-羥基化酶基因ksh連接于載體pET32a上，成功構建pET32a-ksh質粒，將該質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3),獲得高表達重組轉化子菌株,經IPTG低溫誘導,SDS-PAGE電泳分析,目的蛋白主要為可溶性表達,表達量占菌體總蛋白的30％以上。其研究為利用基因工程菌進行工業化生產甾體藥物奠定了基礎。

發明內容

本發明提出了一種微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法，用于解決背景技術中的上述問題。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一種微生物發酵生產9α-羥基雄烯二酮的方法，利用重組恥垢分枝桿菌發酵轉化植物甾醇生產9α-羥基雄烯二酮，包括如下步驟：第一步，重組表達載體pMV261-ksh的構建；第二步，重組菌株的構建；第三步，菌種繁殖及發酵轉化。