[發明專利]一種防治幽門螺桿菌的含分子內佐劑的重組基因、蛋白及生物制品

在審

• 申請號: 201410411940.X
• 申請日: 2014-08-21
• 公開（公告）號: CN104151435A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 潘興;祝潔;周永君;高禮珍
• 申請（專利權）人: 四川萬可泰生物技術有限責任公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;A61K48/00;A61K39/02;A61K39/39;A61K39/40;A61P31/04
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 譚新民

技術領域

本發明涉及疫苗和抗體制藥方面的生物技術領域，具體地說，涉及一種防治幽門螺桿菌的含分子內佐劑的重組基因、蛋白及生物制品。

背景技術

幽門螺桿菌（Helicobacter?pylori，Hp）是1982年發現的一種重要的致病菌，目前研究表明該細菌除引起胃炎、胃潰瘍外，其與MALT淋巴瘤和胃癌的關系非常密切，是目前唯一被WHO公布的與人腫瘤發生相關的細菌性病原。最近研究還發現Hp與人冠心病等心血管疾病也有高度的相關性。Hp可感染老人、小孩和青壯年，但不同國家和地區，因經濟水平和生活習慣不同感染率差異很大。我國的普通人群的感染率約50-80%，且每年以1-2%的速度增加。

1989年Hp的尿素酶基因被克隆出，1997年Hp的全基因序列測定完成。Agnes等利用shutte克隆技術對尿素酶進行分析，證實編碼尿素酶一組基因位于4.2?kb?DNA片段中，并確定這組基因中有4個開放性閱讀框架(ORF)，分別稱為ureA、ureB、ureC、ureD。進一步研究發現在ureA、ureB下段的ureC、ureD閱讀框架分別是ureI、ureE、ureF、ureG、ureH，整個尿素酶基因長度約為8?kb。1998法國巴士德研究所Stéphane研究認為ureI基因對Hp的尿素酶的合成無關系，但與Hp的胃內定植非常密切，是Hp在胃定植所必需的基因。2000年Rektorschek用基因突變技術比較研究指出，ure?I?編碼?Hp的尿素膜通道蛋白。ureI基因體外轉錄翻譯成6個片段的跨膜蛋白UreI，該蛋白獨立于Hp的細胞膜上，保護尿素酶在pH低于4時的胃酸性環境的酶活性，實驗發現在pH值大于4時,胞內尿素酶可以不依賴UreI蛋白而維持尿素酶活性,但在pH低于4時ureI是維護尿素酶活性必需基因。2001年David?L.?Weeks研究認為UreI是Hp聯系尿素酶和在胃內定植的重要通道蛋白，UreI對Hp在胃定植起關鍵作用。有研究用非洲爪蛙卵細胞（Xenopus?oocytes）作為轉基因細胞模型，觀察表達的UreI能在酸性條件下促進尿素吸收，而細胞周質第123位組氨酸（histidine123）缺失的ureI突變體無促進尿素吸收作用，同時UreI介導的尿素轉運是尿素特異的、被動的、非飽和的、非極性的和非溫度依賴性的。Weeks指出UreI是Hp的H+控尿素通道，調控細胞內尿素酶代謝，對Hp在胃的定植和生存非常必要。David?R.Scott研究認為在有尿素的情況下，UreI在pH?≤5時刺激胞內氨產生，但用乙酰胺代替尿素卻無此現象。

尿素酶是螺桿菌屬富含的一種金屬酶，能夠水解代謝尿素，釋放氨中和胃酸，使細菌增強抵抗胃部強酸，穿過胃黏液層到達黏膜表面；能夠激活單核吞噬細胞和刺激炎性細胞因子的產生，在體外實驗中對人胃上皮細胞仍具有毒性作用。Hp尿素酶既是定植因子又是毒力因子，分布在Hp的表面，占全菌蛋白的5％-10％，它由A、B兩個亞單位組成，呈六聚體，由尿素酶A(UreA)、尿素酶B(UreB)兩亞單位組成，幾乎所有Hp菌株均能產生。通過不同菌株的比較，其Ure?B氨基酸同源性達到97.9％以上，表明Hp菌株間Ure?B的抗原變異性極小，保守性好，實驗證實，通過黏膜免疫途徑給予UreB蛋白疫苗，能夠誘導并激發機體的保護性免疫應答，因此是Hp重要的保護性候選抗原。

UreI蛋白是一種pH?依賴的尿素通道，是Hp定植于胃粘膜所必須。胃液中的尿素通過該通道進入Hp胞內，再通過Hp細胞質中的尿素酶使其分解成NH₃和CO₂，NH₃和CO₂擴散至細胞外，NH₃中和胃酸，CO₂和HCO3^-?緩沖液維持Hp細胞外周質的pH至6.1。Mollenhauer等研究結果顯示,?如能采取有效的手段抑制ureI的活性,?則能清除胃內的Hp的定植。Scott等通過基因表達微點陣分析證實,?在沙鼠感染Hp后,?ureI的表達出現了上調（>2倍）。