[發明專利]一種生物膜α-變形細菌的定量檢測方法

無效

• 申請號: 201410411810.6
• 申請日: 2014-08-20
• 公開（公告）號: CN104152569A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 戴婕;王雪峰;張麗麗;李偉英;張東;王錚
• 申請（專利權）人: 上海浦東威立雅自來水有限公司;上海城市水資源開發利用國家工程中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 上海君鐵泰知識產權代理事務所(普通合伙) 31274
• 代理人: 潘建玲

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，特別涉及一種能夠滿足對微生物群落結構變化進行動態監測的要求、定量檢測的數據更加準確、全面、靈敏的生物膜α-變形細菌的定量檢測方法。

背景技術

變形菌門是細菌中最大的一門，包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、孤菌、螺桿菌等，變形細菌均為革蘭氏陰性菌。根據rRNA的不同，變形菌通常分為5類，分別用希臘字母α、β、γ、δ和ε命名。無論作為共生體還是病原體，變形細菌均與真核生物有著密切的交互作用。在城市給水系統中，變形細菌占有主導性，α-變形菌除包括光合的種類外，還具有代謝C1化合物的種類、植物共生的細菌，例如：根瘤菌屬、動物共生的細菌和一類危險的致病菌立克次體目。

目前，國內對水處理工藝及管網生物膜生長和結構的研究較少，并且方法大多停留在細菌學指標階段，較多采用傳統純培養技術來檢測分析微生物，對于大多數微生物的樣本，微生物形態學僅能提供極少的線索。再者，基于培養的微生物檢測技術由于存在高度的選擇性和費時、費力等缺點，不能滿足分析微生物群落的結構與功能關系的需要。除此之外，許多有機體是不可培養的，生態系統中微生物多樣性難以被確定；傳統的分離計數技術也難以滿足對微生物群落結構變化進行動態監測的要求。

因此，分子生物學技術領域迫切需要一種針對α-變形細菌的定量檢測分析更為準確、全面、靈敏的生物膜α-變形細菌的定量檢測方法。

發明內容

本發明提供了一種生物膜α-變形細菌的定量檢測方法，技術方案如下：

一種生物膜α-變形細菌的定量檢測方法，其中，包括如下步驟：

步驟一，對α–變形細菌的標樣進行預處理，得到新鮮活化的標樣菌液，具體操作如下；

將在低溫下保存的α-變形細菌標樣取出，將其溶解至室溫，并且充分混勻；

進一步地，取混勻后的液態α-變形細菌標樣加入滅菌的LB液體培養基中；

進一步地，將其置于恒溫搖床中進行培養，培養后得到新鮮活化的標樣菌液；

步驟二，大腸埃希氏菌感受態細胞的制備，具體操作如下：

A.選用大腸埃希氏菌菌株，并且從LB固體平板上挑取單菌落置于滅菌的LB液體培養基中；

進一步地，將其置于恒溫搖床中進行培養，培養后得到新鮮大腸桿菌菌液；

B.將A中新鮮培養的大腸桿菌菌液充分混勻，取此大腸桿菌菌液放入滅菌的LB液體培養基中；

進一步地，將其置于適當溫度下進行培養；

C.取B中培養后得到的大腸桿菌菌液；

進一步地，將其放在離心機中預冷，使其降溫；

進一步地，將其放在離心機中進行高速離心，并緩慢去除上清液；

D.向C中已經去除上清液的大腸桿菌菌液中加入預冷的滅菌CaCl₂，充分混勻；混勻后，繼續加入預冷的滅菌CaCl₂；

E.將裝有D中菌液的離心管放在散冰中靜置；

進一步地，將靜置后的離心管放在離心機中高速離心，并緩慢去除上清液；

進一步地，向此離心管中繼續加入預冷的滅菌CaCl₂，在散冰上輕柔地搖勻，得到大腸埃希氏菌感受態細胞；

步驟三，將步驟一中經過預處理的α–變形細菌標樣轉化入步驟二中的大腸埃希氏菌感受態細菌菌液中，為考察感受態效果，選用陽性質粒進行轉化試驗，具體操作如下：

A.分別從步驟二中制得的大腸埃希氏菌感受態細菌菌液中提取等量的液體放入2個離心管中；

進一步地，一個不加入任何其他試劑，作為陰性對照；

進一步地，向另一個離心管中加入陽性質粒，作為陽性對照；

進一步地，將2個離心管都置于冰水混合物中，進行冰水浴；

B.將A中冰水浴后的2個離心管分別放入水浴中進行熱激；

進一步地，迅速將熱激后的2個離心管再次放置于冰水浴中冷卻；

C.向B中冰水浴后的2個離心管中分別加入滅菌的LB液體培養基，混勻后將2個離心管都置于恒溫搖床中進行培養、復蘇；

進一步地，將復蘇后的2個離心管都放在離心機中高速離心，并緩慢去除上清液；

進一步地，將去除上清液的2個離心管充分混勻，混勻后將2個離心管內的菌液分別涂布到含氨芐青霉素的2塊LB固體平板上；

進一步地，分別倒置2塊LB固體平板，并且將其都放在適當溫度下進行培養；