[發明專利]一種生物膜α-變形細菌的定量檢測方法

無效

• 申請號: 201410411810.6
• 申請日: 2014-08-20
• 公開（公告）號: CN104152569A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 戴婕;王雪峰;張麗麗;李偉英;張東;王錚
• 申請（專利權）人: 上海浦東威立雅自來水有限公司;上海城市水資源開發利用國家工程中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 上海君鐵泰知識產權代理事務所(普通合伙) 31274
• 代理人: 潘建玲

1.一種生物膜α-變形細菌的定量檢測方法，其特征在于，包括：

步驟一，對α–變形細菌的標樣進行預處理，得到新鮮活化的標樣菌液，具體操作如下；將在低溫下保存的α-變形細菌標樣取出，將其溶解至室溫，并且充分混勻；

進一步地，取混勻后的液態α-變形細菌標樣加入滅菌的LB液體培養基中；

進一步地，將其置于恒溫搖床中進行培養，培養后得到新鮮活化的標樣菌液；

步驟二，大腸埃希氏菌感受態細胞的制備，具體操作如下：

A.選用大腸埃希氏菌菌株，并且從LB固體平板上挑取單菌落置于滅菌的LB液體培養基中；

進一步地，將其置于恒溫搖床中進行培養，培養后得到新鮮大腸桿菌菌液；

B.將所述A中新鮮培養的大腸桿菌菌液充分混勻，取此大腸桿菌菌液放入滅菌的LB液體培養基中；

進一步地，將其置于適當溫度下進行培養；

C.取所述B中培養后得到的大腸桿菌菌液；

進一步地，將其放在離心機中預冷，使其降溫；

進一步地，將其放在離心機中進行高速離心，并緩慢去除上清液；

D.向所述C中已經去除上清液的大腸桿菌菌液中加入預冷的滅菌CaCl₂，充分混勻；混勻后，繼續加入預冷的滅菌CaCl₂；

E.將裝有所述D中菌液的離心管放在散冰中靜置；

進一步地，將靜置后的離心管放在離心機中高速離心，并緩慢去除上清液；

進一步地，向此離心管中繼續加入預冷的滅菌CaCl₂，在散冰上輕柔地搖勻，得到大腸埃希氏菌感受態細胞；

步驟三，將所述步驟一中經過預處理的α–變形細菌標樣轉化入所述步驟二中的大腸埃希氏菌感受態細菌菌液中，為考察感受態效果，選用陽性質粒進行轉化試驗，具體操作如下：

A.分別從所述步驟二中制得的大腸埃希氏菌感受態細菌菌液中提取等量的液體放入2個離心管中；

進一步地，一個不加入任何其他試劑，作為陰性對照；

進一步地，向另一個離心管中加入陽性質粒，作為陽性對照；

進一步地，將2個離心管都置于冰水混合物中，進行冰水浴；

B.將A中冰水浴后的2個離心管分別放入水浴中進行熱激；

進一步地，迅速將熱激后的2個離心管再次放置于冰水浴中冷卻；

C.向B中冰水浴后的2個離心管中分別加入滅菌的LB液體培養基，混勻后將2個離心管都置于恒溫搖床中進行培養、復蘇；

進一步地，將復蘇后的2個離心管都放在離心機中高速離心，并緩慢去除上清液；

進一步地，將去除上清液的2個離心管充分混勻，混勻后將2個離心管內的菌液分別涂布到含氨芐青霉素的2塊LB固體平板上；

進一步地，分別倒置2塊LB固體平板，并且將其都放在適當溫度下進行培養；

D.培養后，觀察2塊LB固體平板，若陰性平板無菌落，陽性平板菌落較多，則證明大腸埃希氏菌感受態菌液制作效果良好，將所述步驟一中制得的α-變形細菌復蘇活化后的新鮮菌液與所述步驟二中制得的大腸埃希氏菌感受態菌液相連接，具體操作為：

首先，分別從所述步驟二中制得的大腸埃希氏菌感受態菌液中提取等量的液體放入多個離心管中；

進一步地，一個不加入任何其他試劑，作為陰性對照，標記為空白樣；

進一步地，向其它離心管中分別加入α-變形細菌復蘇活化后的新鮮菌液，對應標記為α-變形細菌；

進一步地，將所有離心管都置于冰水混合物中進行冰水浴，并重復所述步驟三中的步驟B-C；

進一步地，培養后的多塊LB固體平板為α-變形細菌轉化入大腸桿菌后的新鮮變形細菌菌落產物；

步驟四，對所述步驟三中制得的α-變形細菌轉化入大腸桿菌后的新鮮變形細菌菌落產物的挑菌培養，具體操作如下：

首先，在滅菌的LB液體培養基中加入氨芐青霉素；

進一步地，向滅菌后的離心管中，加入從所述步驟三中制得的α-變形細菌轉化入大腸桿菌的LB固體平板中挑出的單個菌，再加入上述含有氨芐的LB液體培養基；

進一步地，將上述離心管置于恒溫搖床中進行培養；

步驟五，采用質粒抽提試劑盒對所述步驟四中培養后的挑菌進行質粒提取，提取方法按試劑盒說明所述進行；

步驟六，采用超微量核酸蛋白測定儀對所述步驟五中α-變形細菌提取的質粒進行定量雙鏈DNA含量的測定；

步驟七，進行待測生物膜的預處理，具體操作為：

首先，從水處理工藝或管道內壁采集生物膜樣品；

進一步地，向采集的生物膜樣品中加入適量的滅菌生理鹽水，并進行超聲預處理；

進一步地，采用提取DNA試劑盒進行DNA的提取；

進一步地，DNA提取完畢后，采用瓊脂糖凝膠電泳或通過PCR擴增再電泳對提取的DNA進行定量測量；

步驟八，對所述步驟五、七中的標準α-變形細菌、生物膜樣品分別采用實時熒光定量PCR檢測，具體操作為：

A.標準α-變形細菌的檢測；

根據所述步驟六中α-變形細菌的DNA含量的測定結果，將所述步驟五中α-變形細菌的質粒原液做5～10倍的連續梯度稀釋，將稀釋后的α-變形細菌的質粒菌液作為標準品；進一步地，根據所述實時熒光定量PCR反應體系、條件繪制不同濃度的的α-變形細菌標準品的標準曲線，來測定樣品中目的基因模板量；

B.對生物膜樣品的檢測；

步驟九，對所述步驟八中測得的DNA含量進行結果分析；

對步驟八中測得的DNA含量進行擴增曲線、熔解曲線和標準曲線的分析，當回歸系數R²>0.99且擴增效率在0.9-1.1之間時，認為擴增有效且結果可信；

根據步驟六中測得的DNA含量及其擴增結果的分析，得到標準曲線方程y＝-ax+b，得到DNA濃度x值；其中，y為循環閾Ct值，x為以10為底的對數，表示DNA濃度，a為熒光值，b為初始模板量；以a接近于3.33且初始b在38-40之間時為最佳。