[發(fā)明專利]一種抗MPO-ANCA抗體免疫層析試紙的制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410411683.X
• 申請日: 2014-08-20
• 公開（公告）號: CN104764881A
• 公開（公告）日: 2015-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳菲;李振軍;霍如松;周陽
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州和銳醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558;G01N33/564
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種抗MPO-ANCA抗體免疫層析試紙條，包括樣品墊(1)、結(jié)合墊(2)、分析膜(3)、吸水墊(6)、底板(7)、檢測帶T線(4)和質(zhì)控帶C線(5)，所述底板(7)的上部貼合有分析膜(3)，所述分析膜(3)上部的兩端分別貼合有結(jié)合墊(2)和吸水墊(6)，所述結(jié)合墊(2)上部的一端貼合有樣品墊(1)，所述檢測帶T線(4)和質(zhì)控帶C線(5)設(shè)置在分析膜(3)上，其特征在于，MPO-ANCA抗原蛋白結(jié)合在結(jié)合墊(2)上或包被在檢測帶T線(4)上。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于：所述的結(jié)合墊(2)包被膠體金標(biāo)記物或膠乳(乳膠)標(biāo)記物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MPO-ANCA抗體檢測試紙條，其特征在于，所述的結(jié)合墊為1層，如圖1所示與分析膜搭接，或者分上(2a)、下(2b)兩層與分析膜錯落搭接(圖2)。

4.一種抗MPO-ANCA抗體免疫層析試紙條的制備方法，包括如下步驟：

步驟1.MPO-ANCA抗原蛋白的制備

步驟2.結(jié)合墊(2)制備

(1)納米金標(biāo)記物的制備：用納米金溶液標(biāo)記MPO-ANCA抗原蛋白、抗人IgG抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA)、鏈球菌G蛋白(Protein?G)，以及其他與檢測帶T線和質(zhì)控帶C線能形成免疫復(fù)合物的蛋白。

(2)彩色膠乳標(biāo)記物的制備：用帶活性基團(tuán)的彩色膠乳標(biāo)記MPO-ANCA抗原蛋白、抗人IgG抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA)、鏈球菌G蛋白(Protein?G)，以及其他與檢測帶T線和質(zhì)控帶C線能形成免疫復(fù)合物的蛋白。

(3)結(jié)合墊(2)制備：玻璃纖維膜或聚脂膜作為結(jié)合墊，將步驟(1)制備的納米金標(biāo)記物或膠乳標(biāo)記物，用噴涂儀噴涂在預(yù)處理的玻璃纖維膜或聚脂膜上，干燥備用。

步驟3.分析膜(3)制備

A.檢測帶T線(4)制備：根據(jù)結(jié)合墊標(biāo)記蛋白類型選擇檢測帶T線包被蛋白，如結(jié)合墊上的結(jié)合蛋白含MPO-ANCA抗原蛋白，檢測帶T線的包被蛋白是抗人IgG抗體。如果結(jié)合墊上含有抗人IgG抗體，檢測帶T線包被蛋白為MPO-ANCA抗原蛋白。

B.質(zhì)控帶C線(5)制備：根據(jù)結(jié)合墊的標(biāo)記蛋白類型選擇質(zhì)控帶的包被蛋白，如結(jié)合墊標(biāo)記蛋白是單一的MPO-ANCA，質(zhì)控帶C線的包被蛋白為抗MPO-ANCA的抗體；如果結(jié)合墊標(biāo)記蛋白是單一的抗人IgG抗體，質(zhì)控帶C線的標(biāo)記蛋白為對應(yīng)的抗人IgG抗體的抗體；結(jié)合墊標(biāo)記蛋白有2層時(shí)，質(zhì)控帶C線的包被蛋白是能與結(jié)合墊對應(yīng)層結(jié)合蛋白形成免疫復(fù)合物的蛋白。

步驟4.樣品墊制備

將玻璃纖維膜或聚酯膜經(jīng)緩沖液浸漬烘干備用，或者直接使用。

步驟5.試紙條組裝

把步驟1～4所制作完成的材料，按圖1或圖2搭接，根據(jù)底板的規(guī)格切割成一定的長度和寬度，安裝在底板和卡殼里。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于：所述的MPO-ANCA抗原蛋白是把全長MPO-ANCA基因或者含有重要抗原表位的基因序列，克隆到原核或真核表達(dá)載體里，表達(dá)純化獲得。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于：所述的MPO-ANCA抗原蛋白是用多肽合成儀合成含有MPO-ANCA重要抗原表位的MPO-ANCA多肽，并偶聯(lián)到載體蛋白上而獲得。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫層析試紙條，其特征在于：所述的載體蛋白包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚賴氨酸(PLL)等。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述的抗人IgG抗體為鼠源、兔源、羊源、馬源、駱駝源或豚鼠源中的一種或多種單克隆抗體或多克隆抗體。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述的抗人IgG抗體的抗體是指能與該抗體形成免疫復(fù)合物的蛋白。

10.一種抗MPO-ANCA抗體檢測方法，其特征在于，用權(quán)利要求1～9所述的免疫層析試紙條，對待檢樣品進(jìn)行檢測，具體步驟包括：

(1)樣本處理：取血清、血漿或全血樣本，用加樣緩沖液稀釋0～100倍；

(2)把上述處理過的樣品滴加到試紙條的樣品墊上，靜置5～30分鐘，觀察T線和C線；

(3)結(jié)果判讀：T線和C線均顯現(xiàn)，結(jié)果為陽性；T線不顯現(xiàn)，C線顯現(xiàn)，結(jié)果為陰性；T線和C線均不顯現(xiàn)或其他現(xiàn)象，提示試紙失效。