[發明專利]一種腫瘤微環境的體外構建方法及其在藥敏篩選中的應用

有效

• 申請號: 201410411627.6
• 申請日: 2014-08-20
• 公開（公告）號: CN104342405A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 王守立
• 申請（專利權）人: 蘇州堪賽爾生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02
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技術領域

本發明涉及一種腫瘤微環境體外構建的方法及其應用，該方法通過構建一種類似細胞體內微環境的三維支架，腫瘤組織全細胞接種后能促進各細胞生理活性的恢復，從而建立腫瘤微環境，用于腫瘤個性化治療的藥物篩選。

背景技術

隨著現代醫學的不斷進步和人們對于惡性腫瘤認識的逐漸深入，腫瘤的治愈率在近二十年來不斷提高(Cancer?statistics?2014，CA?Cancer?J?Clin?2014；64:9–29)，但惡性腫瘤在35～59歲年齡組中，仍居死因第一位。據統計，到2050年全世界將出現3億腫瘤患者，其中2億人將因此失去生命。

盡管腫瘤的治療取得了很大的進展，但腫瘤的異質性對腫瘤的治療提出了新的挑戰。同一類型的腫瘤在不同個體間的死亡率、生存率、藥物敏感性等方面存在顯著的差異。因此，越來越多的學者參與到腫瘤個性化治療的研究和實踐中。關于腫瘤治療方面的研究包括基因、蛋白質、信號轉導、代謝通路等，這些都與腫瘤藥物治療的反應性、預后、治療效果判斷及藥物抵抗、不良反應等相關。目前，以這些疾病分子為基礎開展的基因治療、免疫治療等腫瘤的個性化治療已取得了令人鼓舞的結果。然而，隨著大量的生物靶向性藥物的臨床應用，陸續出現的毒副作用也越來越受到關注(Cancer?Treatment?Reviews,2014；40:883-891)。這些藥物的毒副作用無法在臨床應用前被發現，根本原因就是基礎研究和臨床研究之間的差異性，我們所立足的體外研究平臺無法證實反映腫瘤微環境的生理狀態，因此，成功構建接近腫瘤真實微環境的研究模型就是解決上述問題的關鍵途徑之一。

臨床上對腫瘤性質的判斷均以形態病理學的診斷為金標準，而病理形態學診斷，除了根據腫瘤細胞異型性的改變外，最重要的要結合腫瘤細胞所處的組織學背景，包括各種腫瘤間質成分的特點。腫瘤細胞株是我們常用的研究對象，我們所從事的細胞學水平的研究也基本上是在二維培養狀態下進行，由于體內細胞(不論是貼壁還是非貼壁生長的細胞)均是在一定基質支撐下生長，因此體外的二維培養環境不能真實反應細胞的體內環境。另外，臨床上目前推廣使用的腫瘤化療藥敏篩選試驗，也是立足于腫瘤細胞的二維培養中實施的，因此所得到的結果不能真實反映腫瘤組織在人體內的真實敏感性。

近年來，三維培養技術逐漸成為細胞培養領域研究的熱點，其利用各種材料與方法，使細胞附著在立體空間內生長，其生長更接近于細胞的體內生長模式，形成類似體內的組織結構，發揮其生理功能。常見的技術包括自發性細胞聚集、預置基質培養、基質覆蓋培養和微載體培養等。其中，預置基質培養提供了與細胞體內生長類似的支架環境，且操作相對簡單，但關鍵取決于基質材料選擇。目前常用的基質來源于膠原蛋白I、明膠或提取的細胞外基質等動物性凝膠，但動物性凝膠價格昂貴且含有很多不確定成分。

中國專利CN102952279A公布了用甲基乙烯基醚/馬來酸共聚物和交聯劑反應制備水凝膠的方法及其在腫瘤組織培養中運用，但由于該基質膠中含有大量細胞生長因子(如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子及組織纖維酶原活化因子)，這些細胞因子對培養細胞作用的不確定性。

CN101445971A、CN103418029A公開了由絲素蛋白、殼聚糖制成的一種仿生細胞外基質絲素蛋白/殼聚糖復合納米纖維，CN103418029A公開了由絲素蛋白、殼聚糖制成的一種絲素/殼聚糖復合多孔支架，為細胞生長和組織再生提供最佳的仿生生理環境。然而其所制備的絲素蛋白/殼聚糖復合納米纖維以及復合多孔支架的穩定性相對低，難適合于實際應用。

CN102010601A、CN101624472A和CN101624473A公開了由絲素蛋白、半乳糖基化殼聚糖在交聯劑的作用下制得一種肝細胞特異性大孔微載體支架材料，適合于大規模培養肝細胞。其缺點在于制作工藝繁瑣(殼聚糖經過糖基化后交聯，后再用網篩過濾)，且所制備的支架材料屬大孔徑支架，應用范圍有限。

CN102942660A公開了一種天然生物交聯的納米復合三維凝膠支架，由丙烯酰胺類單體、無機納米粘土、生物高分子和生物交聯劑京尼平溶于水原位自由基聚合而成，可用于醫用移植、藥物釋放和細胞培養。其缺點在于所使用的主要材料丙烯酰胺類受高熱分解易釋放出刺激性氣體；且在酸堿環境下轉變成的丙烯酸對細胞有較強的毒性作用。

發明內容