[發明專利]一種腫瘤微環境的體外構建方法及其在藥敏篩選中的應用

有效

• 申請號: 201410411627.6
• 申請日: 2014-08-20
• 公開（公告）號: CN104342405A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 王守立
• 申請（專利權）人: 蘇州堪賽爾生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種腫瘤微環境的體外構建方法，包括將腫瘤組織全細胞接種于三維基質支架上進行培養的步驟，其中所述的三維基質支架是由絲素蛋白類物質、殼聚糖和交聯劑經交聯反應而制得，其特征在于所述的絲素蛋白類物質是由蠶繭殼或蠶絲經過脫膠、溶解、透析、干燥制得絲素粉，絲素粉再經如下方法制得所述的絲素蛋白類物質：

(1)將絲素粉溶解于溴化鋰溶液中；

(2)將步驟(1)的溶解后的絲素溶液用截流分子量為3500Da的透析袋進行透析，制得透析后的絲素溶液；

(3)將裝有步驟(2)所制得的透析后的絲素溶液的透析袋放入聚乙二醇6000粉中進行濃縮，所得濃縮液離心后取上清液，即得所述的絲素蛋白類物質。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的交聯劑為1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。

3.根據權利要求1－2所述的方法，其中將所述的絲素蛋白類物質、殼聚糖和交聯劑交聯反應后所得反應產物經梯度冷凍得到所述的基質支架，所述的梯度冷凍過程如下：

(1)將反應產物先放入-20℃冰箱中預冷凍12～48h，再放入-80℃低溫冰箱中冷凍12～48h，最后放入冷凍干燥機冷凍干燥24～72h，得到初制的三維支架材料；

(2)將步驟(1)制得的初制的三維支架材料浸入無水甲醇及10％氫氧化鈉(體積比1:1)溶液浸泡12～48h，用去離子水沖洗后,置于冷凍干燥機內干燥24～72h后取出即得。

4.根據權利要求1－3所述的方法，其中通過改變絲素蛋白類物質、殼聚糖和/或交聯劑的用量以制得不同孔徑和構象的三維基質支架。

5.根據權利要求1－4所述的方法，其特征在于包含如下步驟：

(1)制備絲素蛋白類物質的溶液

1)將蠶繭殼剪成碎片后加入濃度為0.5％的碳酸鈉溶液煮沸2－3遍，再用去離子水洗后進行烘干；

2)將步驟1)制得的干燥絲素加入煮沸的50％氯化鈣溶液攪拌溶解，冷卻后過濾；

3)將濾液裝入透析袋中用去離子水透析制得絲素蛋白溶液，用保鮮袋封裝，依次放入-20度冰箱、-80度冰箱，最后放入冷凍干燥器中進行干燥制得絲素粉；

4)稱取步驟3)制得的絲素粉10g,溶解于9M溴化鋰水溶液中，室溫下進行攪拌溶解；

5)將步驟4)所制得的溶解后的絲素溶液冷卻至常溫后,倒入截流分子量為3500Da的透析袋中透析2－4天,以去除絲素溶液中的小分子物質；

6)將步驟5)制得的透析后的絲素溶液存放于透析袋,放入聚乙二醇6000粉劑中,干燥濃縮,收集液體,離心取上清液即得；

(2)制備殼聚糖溶液

1)將1mL冰醋酸用去離子水加至100ml得到1％冰醋酸，將pH調至4.6；

2)稱取殼聚糖(脫乙酰度>90％)加入上述冰醋酸，配制成殼聚糖溶液；

(3)制備交聯支架

1)將步驟(1)所制備的絲素蛋白類物質的溶液和步驟(2)所制備的殼聚糖溶液混合；

2)浸入含50mmol/1的EDC、18mmol/lNHS的95％乙醇水溶液中,4℃下交聯24h；

3)將步驟2)的交聯反應產物放入-20℃冰箱中預冷凍24h，再放入-80℃低溫冰箱中冷凍24h，最后放入冷凍干燥機冷凍干燥48h，得到初制的三維支架材料；

4)將步驟3)所制的支架材料浸入無水甲醇及10％氫氧化鈉(體積比1:1)溶液浸泡24h，用去離子水沖洗3遍后,置于冷凍干燥機內干燥48h后取出，即得所述的三維基質支架；

(4)將腫瘤組織全細胞接種于步驟(3)制得的三維基質支架上進行培養。

6.根據權利要求5所述的方法，其中所述的絲素蛋白類物質溶液的濃度為1％－5％，所述的殼聚糖溶液的濃度為1％－5％。